高亲和力Matriptase抑制剂的制作方法
【专利说明】高亲和力Matr i ptase抑制剂
[0001] 本发明涉及胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶matriptase的新颖的高度有效的肽抑制 剂。本发明的优选分子SDMI-I和2是药学相关蛋白酶matriptase在近生理pH的有效抑 制剂，并且因此，可应用于治疗或诊断中。
[0002] 胰蛋白酶是脊椎动物的小肠中广泛存在的最主要的消化酶之一。[1]其有趣的分 子构架包括著名的催化三联体Asp-His-Ser作为执行其蛋白水解活性的核心特征。[2]该 原型结构和切割碱性残基之后的肽键的能力构成被称为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的生物 催化剂的整个类别的结构和功能基础。[3]该酶家族的成员参与多种生物过程，并且以可溶 形式或作为膜锚定实体存在。[4]11型跨膜丝氨酸蛋白酶（TTSP)，例如，经由N-末端结合 至细胞表面，并且已经表征为各种效应分子的细胞外周加工和活化的重要介体。[3-5]通过 由特定TTSP的内切蛋白水解切割从非活性前体生成肽激素、生长和分化因子、受体、酶和 粘附分子的活性形式。[4]因此，它们在细胞发育和维持体内稳态中发挥关键作用。[3]。
[0003] 与药物相关的膜锚定的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的充分研宄的实例是 matriptase。[6]它在健康组织中的上皮细胞的表面上广泛表达，其中其蛋白水解活性受天 然蛋白酶抑制剂如肝细胞生长因子抑制剂-1和2(ΗΑΙ-1，ΗΑΙ-2)精确调节。[6c，6f]然而， 该生理抑制剂-蛋白酶平衡的失调据信促进病理过程。实际上，许多研宄将matriptase过 表达与上皮肿瘤的发生和进展以及骨关节炎和动脉粥样硬化相关联。[6g-k]此外，Napp等 人观察到鼠原位胰腺肿瘤（orthotopic pancreatic tumor)模型中的明显体内matriptase 活性，并且显示活性位点抑制剂的施用显著降低底物分析物的蛋白水解。[6d]因此，有效且 选择性的matriptase抑制剂具有很大的治疗重要性，并且其开发是一项具有挑战性的任 务。迄今为止，已经报道了表现出个位数纳摩尔至亚纳摩尔抑制常数的许多小的合成有机 化合物以及大的抗体片段。[7]。
[0004] 本发明人使用向日葵胰蛋白酶抑制剂-I (SFTI-I)的刚性且良好定义的十四肽构 架作为结构导向的先导化合物优化的起点。该分子支架具有抗蛋白水解活性的典型（底 物模拟）环，并且已经被成功地用于生成糜蛋白酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、β-类胰蛋 白酶、蛋白酶K或激肽释放酶相关的肽酶的抑制剂。[10]此外，在TTSP的pH最佳值（pH ~8. 5-9)对于双环肽已经报道了纳摩尔范围（Ji = 1-150 nM)的针对matriptase的潜在 抑制活性。[11]最近，我们显示，该中等功效在具有近生理参数Ori = 1.1 μΜ，在pH 7.6) 的环境中基本上降低。这对于潜在的体内应用特别重要。治疗/诊断剂必须在体内稳态下 或一在肿瘤以及炎症诱导的低氧的情况下一更酸性的条件下具有高活性。[12]。
[0005] 使用结构导向的增量优化策略，我们能够生成具有个位数纳摩尔Ki以及具有改 善的胰蛋白酶/matriptase选择性概况的SFTI-I衍生物。
[0006] 最有利的氨基酸取代和随后的C-末端截短的组合得到SFTI-I衍生的matriptase 抑制剂-1和2 (SDMI-1和2)，其具有低纳摩尔至个位数纳摩尔范围的抑制常数。初始肽/ 拟肽文库的结构导向的设计以及氨基酸序列的缩短通过在计算机芯片上实验而启发，所述 计算机芯片上实验用作朝向野生型化合物的有益修饰的想法源泉。[6e]因此，开发具有仅 十二个残基以及有利于后者酶的反向胰蛋白酶-matriptase选择性的抑制剂。
[0007] 虽然使用"铜点击（copper-click) "化学的应用合成策略可适用于大多数含有三 唑基的拟肽1-16的组装，但它与在位置10使用非天然氨基酸叠氮基丙氨酸不相容（化合 物9、11、13和15)。在我们先前的工作中，我们没有观察到使用Fmoc-Aza-OH作为微波辅助 的Fmoc-SPPS的结构单元（building block)的显著限制。[15]然而，通过修改的合成路线 规避了在所述条件下未受保护的叠氮化物官能团（functionality)的意料之外的限制适 用性。
[0008] 包含SFTI-I [7, 74衍生物1 一 22的小化合物文库的设计和合成：
[0009] 包含SFTI-I [7, 74衍生物1 一 22的小化合物文库的设计和合成。A)收集含有 三唑基的肽1 一 16以及在位置10和12具有使用典型氨基酸赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、缬氨 酸、异亮氨酸或组氨酸的单取代的变体17 - 22。B)前体23、24、25和26以及抑制剂17 - 22的合成。C)和D)得到含有三唑基的肽1 一 16的合成途径的示意图。条件：a)微波辅 助的Fmoc-SPPS ;b)使用 TFA/H20/苯甲醚/TES (47:1:1:1，v:v:v:v)和二硫苏糖醇（DTT) 从固体支持物酸解切割，c)以I mg肽/mL在100 mM (順4)20)3水溶液（aq) (ρΗ=8· 4)中的 空气介导的氧化大环化（oxidative macrocyclization) ;d)在环境温度使用DMF中的给 定炔组分（5当量（eq))、CuS04*5H20 (20 mol %)、抗坏血酸钠（20 mol %)和％，二异丙 基乙胺（DIEA，8当量）的树脂上（on-resin) CuAAC(过夜），e)以I mg肽/mL在100 mM (NH4)2CO3水溶液（pH=7. 7)中的空气介导的氧化大环化。所有化合物1 一 22都通过制备型 反相HPLC分离。
[0010] 以下化合物代表本发明的优选实施方案，其中化合物43和44是最优选的。
[0011] 序列 SFTI-IU 74 (野生型）
在位置7 (Rl)UO (R2)和12 (R3)的取代
[0012] 新颖化合物43和44是在近生理pH的pH范围中matriptase的令人惊讶地有效 的抑制剂，并且因此，可应用于治疗或诊断中。
[0013] 因此，本发明的优选实施方案是式I的化合物
式⑴ 其中 R1 表示 A 或（CH2)nHet, R2 表示 A、（CH2)nHet 或（CH2)3NHC (=NH) NH2， R3 表示 A、（CH2)nHet 或（CH2)nAr, A表示具有1、2、3、4、5或6个C-原子的直链或支链烷基， Ar表示苯基， He t表示呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基 (oxadiazolyl)、噻唑基、三唑基或四唑基，其每一个未取代或被（CH2)nNH 2、C00H、C00A或Ar 单取代， η表示0、1、2或3， 和其药学上可接受的溶剂合物、盐、互变异构体和立体异构体，包括其所有比率的混合 物。
[0014] 特别优选的实施方案是式1的化合物，其中 Het表示三唑基或咪唑基，其是未取代的或被（CH2) nNH2、C00H、COOA或Ar单取代，和其 药学上可接受的溶剂合物、盐、互变异构体和立体异构体，包括其所有比率的混合物。
[0015] 进一步实施方案是根据式（I)的化合物， 其在位置Rp馬和/或R 3具有非天然存在的取代。
[0016] 一个特别优选的实施方案是根据式1的突变的SFTI，其中RpRjP/或R3选自 C1-Cjg级烷基或芳基烷基。
[0017] 优选的是以下化合物，特别是42、43和44,且最好的实施方案是43和44。
[0018] 这些化合物可用于包含本发明的突变的SFTI和药学上可接受的赋形剂的药物组 合物。
[0019] 此类药物组合物可用于治疗癌症。
[0020] 此类药物组合物的进一步优选的用途包括治疗matriptase蛋白酶功能障碍相关 的疾病，其中所述疾病选自癌症、慢性阻塞性肺疾病、外周或中枢神经系统的病症或心血管 病症，由此matriptase功能障碍相关的疾病的症状得到减轻。
[0021] 步骤1 :调整单数残基的亲和力（增量） 胰蛋白酶和matriptase共享非常相似的底物谱。因此，我们推理SFTI-I [7, 74的典 型区域内的取代对于改善的亲和力是不利的。然而，在我们的分子设计中，我们包括P2M立 置（Ile7)作为侧链替代的位点。Matriptase的组氨酸40和143与该残基密切靠近，因此 它们可能提供与配体的有利的氢键键合相互作用的可能性。
[0022] 为了降低合成费用且覆盖足够的结构和功能空间，我们设置了不同的合成程序。 使用市售的结构单元Fmoc-L-叠氮基丙氨酸（Fmoc-Aza-OH)和Fmoc-L-叠氮基高丙氨酸 (Fmoc-Aha-OH)将携带叠氮化物的肽支架23和24组装在固体支持物上。用不同的炔组 分的树脂上铜（I)-催化的叠氮化物-炔环加成（CuAAC)允许方便安装胺、羧酸、相应的甲 酯和位置7的苯基官能团。该组合方法与Burk和同事先前描述的"拴系片段（tethered fragment)"策略相当类似。[13]从固体支持物的酸解切割、氧化大环化和层析分离得到 SFTI-I [7, 74衍生物1 一 8。有趣地，通过选择大环化条件，游离羧酸3和4以及相应的甲 酯5和6可从各自的开链甲酯前体肽选择性获得。在pH 8.4形成二硫键过程中水解羧酸 甲酯，得到游离酸3和4。然而，将pH设定至7. 7允许保留甲酯基团，得到相应的胱氨酸桥 联的（cystine-bridged) 5 和 60
[0023] 不幸地，位置7变体1 一 8无一在酶抑制测定中显示相对于SFTI-I [7, 74改善的 matriptase亲和力（表1)。因此，我们将我们的进一步实验集中于位置10和12的优