多肽、包含该多肽的检测器件和包含该器件的检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，特别是可用于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助 诊断的多肽、包含该多肽的检测器件的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型IgM属于肠道病毒属A型，肠道病毒一般是以数字命名的，排 列顺序代表着其发现的先后次序。按顺序，这种病毒被命名为肠道病毒71型（Human enterovirus 71)，简称 EV71，是引起婴幼儿手足口病（hand-foot and mouth disease; HFMD)主要病原体之一。人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统 疾病的婴儿粪便标本中分离出来的。
[0003] EV71主要引起手足口病，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻 痹等多种神经系统疾病。手足口病和中枢神经系统感染是EV71感染而引起的两大常见临 床症状。病毒从咽部或肠道侵入，在局部黏膜或淋巴组织中繁殖，并由局部排出，此时可引 起局部症状。继而病毒又侵入局部淋巴结，并由此进入血液循环导致第一次病毒血症。病毒 经血循环侵入网状内皮组织、深层淋巴结、肝、脾、骨髓等处大量繁殖并由此进入血液循环， 引起第二次病毒血症。病毒可随血流进入全身各器官，如中枢神经系统、皮肤黏膜、心脏等 处，进一步繁殖并引起病变。易感者感染EV71后，出现血管变态反应和组织炎症病变。当 病毒累及中枢神经系统时，组织炎症较神经毒性作用更加强烈，中枢神经系统小血管内皮 最易受到损害。细胞融合、血管炎性变、血栓形成可导致缺血和梗死。在脊髓索、脑干、间 脑、大脑和小脑的局部组织中，除嗜神经性作用外，还存在广泛的血管周围和实质细胞炎症 道病毒71型IgM危害极大，目前急需简便快捷准确的仪器是实现对其的快速检测。
[0004] 市场上检测肠道病毒71型（IgM)多采用酶联免疫检测试剂盒，但试剂盒检 测虽然检出限较低（0. 15mg/L)，但是检测时间长，不适合现场测定，中国专利申请号为 201010171862. 2的发明专利申请，提出一种肠道病毒71型抗体（IgM)诊断试剂盒（酶联免 疫法），该试剂盒检测肠道病毒71型抗体（IgM)前、后都需要做必要的仪器清洗及保养工 作，检测时间长，并且要求本领域专业技术人员来操作。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种多肽、包含该多肽的检测器件、以及包含该检测器件 的检测试剂盒，它们对肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊断有用的。本发明目的在于 提供该多肽在制备可用于肠道病毒71型诊断的检测试剂盒中的用途。
[0006] 即，本发明包含下述技术方案：
[0007] 1. 一种多肽，其氨基酸序列如 SEQ ID NO :1 所示，g卩：ADPGRNGPWQSTLLGQLCGY。
[0008] 2. -种检测器件，其包括：
[0009] 固体载体，以及
[0010] 连接于该固体载体上的权利要求1所述的多肽。
[0011] 3.根据权利要求2所述的检测器件，其中，所述固体载体是SJ改性硅胶。
[0012] 4.根据权利要求2所述的检测器件，其用于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助 诊断。
[0013] 5. -种检测试剂盒，其包括权利要求2~4中任一项所述的检测器件。
[0014] 6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其用于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅 助诊断。
[0015] 7.权利要求1所述的多肽在制备检测试剂盒中的用途。
[0016] 8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测试剂盒用于肠道病毒71型的早期 筛查和临床辅助诊断。
[0017] 9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测试剂盒包括权利要求2~4中任一 项所述的检测器件。
[0018] 将本发明应用于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊断，能够取得令人满意 的效果。
【附图说明】
[0019] 图1对SJ改性硅胶（iPDMS薄膜）的制作过程进行说明的示意图。
[0020]图2说明多肽微阵列点样模式的示意图。
[0021] 图3是显示对健康正常人或非肠道病毒71型感染病人血清进行检测的结果的照 片。
[0022] 图4是显示对肠道病毒71型感染病人血清进行检测的结果的照片。
[0023] 发明的【具体实施方式】
[0024] 本发明的多肽
[0025] 在另一个方面中，本发明提供对对肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊断有 用的多肽，由SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列构成，即：ADPGRNGPWQSTLLGQLCGY如实施例所 示，本发明的多肽对肠道病毒71型感染病人的血清呈阳性反应，而对健康正常人或非肠道 病毒71型感染病人血清呈阴性反应。因此，本发明的多肽作为肠道病毒71型的早期筛查 和临床辅助诊断工具是有用的。本发明的多肽可以用于制造可用于肠道病毒71型的早期 筛查和临床辅助诊断的检测器件（例如下述的本发明的检测器件）或检测试剂盒（例如下 述的本发明的检测试剂盒）。
[0026] 本发明的多肽可以适宜采用（1)化学合成方法、或（2)酶反应合成方法等公知方 法来获得，但不限于此，其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的多肽情况下，通过使 用肽合成仪合成或者半合成该多肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合 成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱 等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本技术领域公知的。
[0027] 此外，在通过酶反应生产本发明的多肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子 W02004/011653号所述的方法。即，可以这样来生产：将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被 酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸（例如羧基保护的 氨基酸）在肽合成酶的存在下进行反应，生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出： 具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体 处理物、或该微生物来源的肽合成酶。
[0028] 而且，除了上述的酶方法、化学合成方法以外，还可以采用例如基因工程方法来生 产本发明的多肽。
[0029] 本发明的多肽的氨基酸序列可以采用常规的方法进行分析和确认，例如可以利用 质谱、色谱等方法来进行分析和确认。
[0030] 本发明的检测器件
[0031] 在另一方面中，本发明还提供一种检测器件（本发明的检测器件），其包括固体载 体、以及连接于该固体载体上的本发明的蛋白质或本发明的多肽。所述检测器件对于肠道 病毒71型的早期筛查和临床辅助诊断是有用的。
[0032] 在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料（例如是 可以通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物中分离的材料）的载体即可。
[0033] 构成固体载体的材料包括但不限于：硅胶（聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纤维素、特 氟隆TM、硝基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚 酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈 钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白（白蛋白等）、碳或它 们的组合等。
[0034] 固体载体的形状包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微量板、碳 纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或板等平坦的固体载体上可以设 置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
[0035] 在本发明中，磁珠可以具有约25nm~约Imm范围的球体直径。在优选的实施方式 中，磁珠具有约50nm~约10 μ m范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
[0036] 在本发明中，由Sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子具有约24 μm~约 165 μ m范围的直径。优选地，高交联球形琼脂糖珠具有约24 μ m~约44 μ m范围的直径。 高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
[0037] 具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences，Warrington，PA