核酸扩增反应用筒和核酸扩增装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸扩增反应用筒和核酸扩增装置。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着基因的利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用基因的医疗备受 关注，此外，在农牧业领域也开发了很多将基因用于品种辨别、品种改进的方法。作为利用 基因的技术，PCR(聚合酶链反应：Polymerase Chain Reaction)法等核酸扩增技术已广泛 普及。如今，PCR法在生物物质的信息解析中已成为不可或缺的技术。
[0003] PCR法中，一般是使用称为管、芯片（以下，称为生物芯片）的用于进行生化反应的 容器来进行反应的方法。然而，在现有的方法中存在如下问题：所需的试剂等的量多，并且 为了实现反应所需的热循环而装置变得复杂，反应耗费时间。因此，需要使用微量的试剂、 样品以短时间进行PCR的生物芯片、反应装置。
[0004] 为了解决这样的问题，专利文献1公开了一种生物芯片和装置：在填充有不与反 应液混合且比重与反应液不同的液体（矿物油等）的管中，使以液滴的状态含有的反应液 往返移动来实施热循环，从而进行反应。
[0005] 然而，将专利文献1中公开的生物芯片用于从容器外部进行荧光测定来检测扩增 产物这样的用途时，需要用透明的材料形成容器。作为透明的材料，可举出树脂、耐热玻璃， 这些材料容易因摩擦等而带电。虽然只要对容器的内表面实施亲水处理就能够抑制带电， 但作为水溶液的反应液会附着于容器而妨碍移动，因此难以对生物芯片采用亲水处理。
[0006] 另一方面，作为不与反应液混合且比重与反应液不同的液体，从对热、反应液的稳 定性的观点出发，可以使用硅油、矿物油，但这些油通常是绝缘体，因此导入到油中的反应 液的液滴容易极化。因此，如果在透明材料的容器中填充油并导入反应液，则有时在反应液 与容器之间产生电场，反应液被吸引而附着于容器的内壁，或者因排斥而悬浮于油中。在 这种状态下，如果进行在生物芯片中像专利文献1所记载的依靠重力使反应液移动的方式 (以下，在本说明书中，将该方式称为"升降型"）的PCR，则有时反应液无法适当地移动，无 法实施所希望的热循环。
[0007] 专利文献2中公开了一种生物芯片：为了消除生物芯片所产生的电荷，对反应液 实施稳定的热循环，在使用填充有不与反应液混合的液体的容器时，使上述液体的体积固 有电阻大于0Ω .cm且小于等于5 XlO13 Ω .cm。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1:日本特开2009-136250号公报
[0011] 专利文献2:日本特开2012-125169号公报
【发明内容】
[0012] 然而，即使像专利文献2那样防止带电，液滴仍会附着于容器，液滴无法依靠重力 在油中移动，研宄了在核酸扩增反应用容器内的油中加入添加剂的技术，但添加剂会阻碍 核酸扩增反应用容器内的核酸扩增反应用试剂的活性。因此，本发明的目的是提供一种以 不阻碍核酸扩增反应用容器内的核酸扩增反应用试剂的活性的方式构成的核酸扩增反应 用筒。
[0013] 本发明的一个实施方式是一种核酸扩增反应用筒，具备管和与上述管连通的核酸 扩增反应用容器；所述管具有长边方向，在内部具备由与油相分离且从结合有核酸的微粒 溶出上述核酸的溶出液构成的溶出液管芯以及由油和第1添加剂构成的第1液体的管芯； 上述核酸扩增反应用容器含有由油和第2添加剂构成的第2液体，上述第1添加剂选自甲 醇改性有机硅树脂、羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅 烷醇改性有机硅树脂以及氟改性有机硅树脂，上述第2添加剂选自甲醇改性有机硅树脂、 羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂 以及氟改性有机硅树脂，上述第1液体中含有的第1添加剂浓度高于上述第2液体中含有 的第 2 添加剂的浓度。上述添加剂是 X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、 KF-867、KF-6017、KF-8005(以上，Shin-Etsu Silicone 公司），SR1000、SS4230、SS4267、 YR3370、XS66-C1191、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197(以上，Momentive 公司） 中的任一种。上述第1添加剂和上述第2添加剂可以是相同的有机硅树脂。另外，将上述 第1液体管芯排出到上述核酸扩增反应用容器时的、上述核酸扩增反应用容器内的上述第 1添加剂的体积与上述第2添加剂的体积的总体积相对于上述第1液体的体积与上述第2 液体的体积的总体积的比例可以为1% (v/v)~20% (v/v)。上述核酸扩增反应用容器可 以含有核酸扩增反应试剂。上述核酸扩增反应试剂可以保持在上述第2液体中。上述核酸 扩增反应试剂可以被冷冻干燥。上述核酸扩增反应试剂可以含有表面活性剂，上述表面活 性剂可以是NP40、Triton-XlOO或Tween20。上述容器可以是聚丙烯制。
[0014] 本发明的另一个实施方式是一种核酸扩增装置，安装有上述任一项的核酸扩增反 应用筒。
【附图说明】
[0015] 图IA和图IB是筒1的说明图。
[0016] 图2A~图2C是筒1的动作说明图。
[0017] 图3A~图3D是罐3的说明图。
[0018] 图4是固定爪25、导板26和安装部62的说明图。
[0019] 图5A和图5B是PCR容器30的周边的说明图。
[0020] 图6A是PCR装置50的内部构成的立体图。图6B是PCR装置50的主要构成的侧 视图。
[0021] 图7是PCR装置50的框图。
[0022] 图8A是旋转体61的说明图。图8B是在旋转体61的安装部62安装了筒1的状 态的说明图。
[0023] 图9A~图9D是安装筒1时的PCR装置50的状态的说明图。
[0024] 图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠 7的行为的概念图。
[0025] 图IlA~图IlC是核酸溶出处理的说明图。
[0026] 图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的行为的概念图。
[0027] 图13是表示磁铁71有无摆动的表。
[0028] 图14A~图14C是液滴形成处理的说明图。
[0029] 图15A和图15B是热循环处理的说明图。
[0030] 图16是表示一个实施例中使用的核酸提取用试剂盒和其组装后的装置的图。
[0031] 图17是表示一个实施例中的实时PCR的结果的图。
[0032] 图18是表示一个实施例中的核酸扩增溶液的保存稳定性能的比较结果的图。
[0033] 图19是表示一个实施例中的实时PCR的结果的图。
【具体实施方式】
[0034] 以下，详细说明本发明的实施方式。应予说明，本发明的目的、特征、优点以及其构 思，根据本说明书的记载，对于本领域技术人员而言是清楚的，根据本说明书的记载，本领 域技术人员能够容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式表示本发明的优选的实施 方式，是为了例示或说明而示出的，本发明并不限定于此。对本领域技术人员来说清楚的是 在本说明书中公开的本发明的意图以及范围内，可以基于本说明书的记载进行各种改变以 及修饰。
[0035] 本发明的一个实施方式是一种核酸扩增反应用筒，具备管和与管连通的核酸扩增 反应用容器；所述管具有长边方向，在内部具备由与油相分离且从结合有核酸的微粒溶出 核酸的溶出液构成的溶出液管芯以及由油和第1添加剂构成的第1液体的管芯；核酸扩增 反应用容器含有由油和第2添加剂构成的第2液体，第1添加剂选自甲醇改性有机硅树脂、 羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂 以及氟改性有机硅树脂，第2添加剂选自甲醇改性有机硅树脂、羧基改性有机硅树脂、氨基 改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂以及氟改性有机硅树脂，第 1液体中含有的第1添加剂浓度高于第2液体中含有的第2添加剂的浓度。
[0036] 以下，详细叙述核酸扩增反应用筒的构成。在说明一般构成时，管内的第1液体的 管芯也作为油管芯进行说明，但在本发明中，管内的任一个以上的油管芯为第1液体的管 芯。
[0037] <筒>
[0038] 图IA和图IB是筒1的说明图。图2A~图2C是筒1的动作说明图。图2A是筒 1的初始状态的说明图。图2B是从图2A的状态挤压柱塞10,密封部件12A接触下注射筒 22时的侧视图。图2C是挤压柱塞10后的筒1的说明图。首先，概述该筒的使用方法。
[0039] 筒1由罐3和包含PCR容器30的筒主体9构成。在构成筒1的试剂盒中，与罐3 和筒主体9 一起预先准备适配体5。可通过介由适配体5连接罐3和筒主体9来组装筒1。 其中，也可以按对筒主体9直接安装罐3的方式构成。
[0040] 在罐3中进行核酸提取处理，核酸与磁珠7结合。管20具有清洗液管芯45、溶出 液管芯47和油管芯。通过使磁铁沿着管20在外部移动，从而使从罐3进入管20的磁珠7 在管20内移动而穿过清洗液管芯45,到达溶出液管芯47。与磁珠7结合的核酸在清洗液 管芯45中被清洗液清洗并在溶出液管芯47中溶出。
[0041] 热循环处理在与管20连通的PCR容器30中进行。PCR容器30被第2液体填满。 溶出液管芯47被从管20推到PCR容器30中时成为液滴状，成为液滴状的溶出液47发生 沉降。在PCR容器30内沉降的溶出液47使位于PCR容器30的冷冻干燥的核酸扩增反应 试剂溶解，成为PCR溶液。在PCR容器30中，利用外部的加热器形成高温区域36A和低温 区域36B，通过反复使筒1整体与加热器一起上下翻转，液滴状的PCR溶液在高温区域36A 与低温区域36B之间交替移动从而被实施2个阶段的温度处理，进行DNA扩增。
[0042] 在以下筒1的详细的构成要素的说明中，如图2A所示，以沿长条的筒1的方向为 "长边方向"，以罐3侧为"上游侧"，以PCR容器30侧为"下游侧"。应予说明，有时也将上游 侧仅表示为"上"，将下游侧表示为"下"。
[0043] (1)罐
[0044] 图3A~图3D是罐3的说明图。
[0045] 在试剂盒中预先准备的罐3中收容有溶解液41和磁珠7。在罐3的开口安装有 可拆卸的盖34(参照图34)。作为溶解液41，使用511硫氰酸胍、2%1'1^〇11乂-100、501111 Tris-HCl (pH7. 2)。操作者取下盖3A，打开罐3的开口（参照图3B)，将附着有病毒的棉棒 浸入罐3内的溶解液41中，将病毒采集到溶解液41中（参照图3C)。搅拌罐3内的液体 时，可以以图3C的状态振荡罐3,但这样溶解液41容易溢出，因此，如图3D所示，优选在将 带盖5A的适配体5安装于罐3的开口后振荡罐3。由此，罐3内的物质得到搅拌，因溶解 液41病毒粒子溶解，核酸游离，并且包覆于磁珠7的二氧化硅吸附核酸。磁珠7相当于核 酸结合性固相载体。其后，操作者取下安装于罐3的开口的适配体5的盖5A，介由适配体5 将罐3安装于筒主体9 (参照图2A)。
[0046] 罐3优选为可塑性且能够膨胀的容器，例如可例示聚丙烯、聚乙烯、环烯烃聚合物 (例如，ZEONEX(注册商标）480R)等树脂。柱塞10滑动而从图2A的状态成为图2B的状态 时，罐3膨胀，由此可抑制管20内的液体的压力过度上升，可抑制管20内的液体被推到下 游侧。优选以罐3容易膨胀的方式在罐3形成变形部3B。
[0047] 应予说明，提取?扩增核酸的试样并不局限于病毒，也可以是细胞。细胞的来源也 没有特别限定，可以是微生物也可以是高等生物的组织切片、血液等。
[0048] 应予说明，溶解液41是指使核酸吸附于作为核酸结合性固相载体的微粒（例如磁 性粒子M)的液体。溶解液41只要含有离液物质就没有特别限定，但出于破坏细胞膜或者 使细胞中含有的蛋白质变性的目的，也可以含有表面活性剂。作为该表面活性剂，只要是 通常用于从细胞等提取核酸的表面活性剂就没有特别限定，具体而言，可举出Triton-X等 Triton系表面活性剂、TWeen20等Tween系表面活性剂这样的非离子性表面活性剂，N-月 桂酰肌氨酸钠（SDS)等阴离子性表面活性剂，特别优选以成为0. 1~2%的范围的方式使 用非离子性表面活性剂。并且，溶解液中优选含有2-巯基乙醇或二硫苏糖醇等还原剂。溶 解液41也可以是缓冲液，但优选为pH6~8的中性。考虑到这些因素，具体而言，优选含有 3~7M的胍盐、0~5%的非离子性表面活性剂、0~0. 2mM的EDTA、0~0. 2M的还原剂等。
[0049] 离液物质只要在水溶液中产生离液离子（离子半径大的1价阴离子），具有增加 疏水性分子的水溶性的作用，并且有助于核酸向固相载体的吸附就没有特别限定。具体而 言，可举出硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠等，其中，优选蛋白质变性作用强的 硫氰酸胍或盐酸胍。这些离液物质的使用浓度根据各物质而异，例如使用硫氰酸胍时，优选 以3~5. 5M的范围使用，使用盐酸胍时，优选以5M以上使用。
[0050] 该溶解液41优选含有醇或乙腈。此时，醇等的浓度没有特别限定，下限可以为 10%以上，也可以为20%以上，也可以为30%以上，最优选为40%以上。上限也可以为80% 以下，也可以为70%以下，也可以为60%以下，最优选为50%以下。醇的种类没有特别限 定，可例示甲醇、乙醇、丙醇等。通过在溶解液中添加醇等，可提高使核酸吸附于粒子等的效 果，作为核酸提取用设备使用时，能够提高核酸的提取效率。
[0051] 另外，采集试样的器具没有特别限定，可以根据用途选择刮铲、棒、刮刀等代替棉 棒。
[0052] 罐3的内容积没有特别限定，例如可以为0.1 mL~100mL。罐3的材质没有特别 限定，例如可以是玻璃、塑料等树脂、金属等。特别是如果选择透明的玻璃、树脂作为罐的材 质，则能够从罐3的外部观察内部，因此更优选。应予说明，罐3与各管20可以一体成型， 也可以是能够装卸的。如果利用橡胶、弹性体、高分子等具有挠性的材料作为罐3的材质， 则通过在罐3安装有盖的状态下使罐3变形，能够对罐3的内部加压。由此，能够从管的前 端侧将管20的内容物从管的内部推向外部。
[0053] (2)筒主体
[0054] 筒主体9具有柱塞10、管20和PCR容器30。
[0055] (2-1)柱塞
[0056] 以下，参照图2A~图2C对柱塞10进行说明。
[0057] 柱塞10是从作为注射筒发挥功能的管20的下游侧推出液体的可动式的推杆。柱 塞10具有将管20内的规定量的液体从管20的末端推向PCR容器30的功能。另外，柱塞 10还具有介由适配体5安装罐3的功能。
[0058] 柱塞10具有筒状部11和棒状部12。筒状部11设置于罐3侧（上游侧），棒状部 12设置于管20侧（下游侧）。棒状部12从筒状部11的下游侧的内壁被板状的2个凸缘 13支撑。棒状部12的下游侧从筒状部11向下游侧突出。
[0059] 筒状部11在上游侧和下游侧开口，筒状部11的内壁成为液体的通路。在筒状部 11的上游侧（罐3侧）的开口嵌合适配体5。在试剂盒中预先准备的筒主体9的柱塞10 可以在筒状部11的上游侧的开口安装有可拆卸的盖。筒状部11的下游侧的开口位于管20 的上注射筒21的内部。从筒状部11的上游侧的开口导入的磁珠7通过筒状部11的内部， 穿过凸缘13的表背而从筒状部11的下游侧的开口出来，导入到管20的上注射筒21。
[0060] 筒状部11的下游侧与管20的上注射筒21的内壁嵌合。筒状部11内接于管20 的上注射筒21，同时相对于上注射筒21能够在长边方向滑动。
[0061] 在筒状部11的上游侧的开口的周围形成有安装适配体5的安装台11A。另外，安 装台IlA也是挤压柱塞10时的挤压部位。通过挤压安装台11A，从而柱塞10相对于管20 滑动，从图2A的状态变为图2C的状态。如果柱塞10向下游侧移动，则安装台IlA接触管 20的上缘（参照图2C)。换言之，柱塞10的安装台IlA与管20的上缘的间隔成为柱塞10 的滑动长度。
[0062] 棒状部12在初始状态下位于管20的上注射筒21的内部，与下注射筒22分离（参 照图2A)。如果柱塞10相对于管20滑动，则棒状部12插入管20的下注射筒22中，棒状部 12内接于下