一种抗原特异性t淋巴细胞的分离和高效扩增培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养技术领域，涉及抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养方法。
【背景技术】
[0002]树突状细胞(dendritic cells，DC)是目前已知功能最强的专职抗原呈递细胞(antigen process cells, APC)，它在诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。用荷载肿瘤抗原的DC作为疫苗进行免疫治疗，能够刺激机体产生针对肿瘤抗原的特异性细胞毒T细胞免疫应答(cytotoxic T lymphocyte, CTL)。肿瘤疫苗可分为基因修饰的树突状细胞疫苗、负载肿瘤抗原多肽的树突状细胞疫苗、转染肿瘤抗原m R N A或R N A的树突状细胞疫苗、完全肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞疫苗等几个种类，目前，负载抗原的DC疫苗在治疗恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌的临床试验中已取得了较好的临床疗效。
[0003]有研宄显示，以DC疫苗联合过继性T细胞免疫治疗效果好，即借助于体外培养技术，将肿瘤抗原诱导活化的DC细胞与患者自体外周血T细胞共培养，然后回输患者体内以达到抗肿瘤的治疗效果。但是，肿瘤抗原诱导活化的DC细胞与外周血T细胞共培养最终得到的细胞是一种异质性的细胞群，包含活化的抗原特异性T细胞和未活化的非抗原特异性T细胞，后者占绝大多数细胞。
[0004]深圳市合一康生物科技有限公司(申请号:201410169608.7)发明的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞的制备方法和成都百赛泰科生物技术有限公司(申请号:201410192581.3)发明的一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法都是将DC细胞与患者自体外周血淋巴细胞共培养得到的异质性的细胞群直接回输患者体内。这些方法得到的抗原特异性T细胞数量少，达不到很好的临床效果，而且这些方法培养的T细胞容易发生已活化诱导的细胞的凋亡，限制了最终得到的T细胞的数量和活性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术分离培养抗原特异性T细胞数量少，培养中T细胞容易发生发生已活化诱导的细胞凋亡的现象，提供了一种可提高抗原特异性T细胞数量同时减少发生已活化诱导的细胞凋亡的抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养方法。
[0006]由于肿瘤抗原诱导活化的DC细胞与外周血T细胞共培养最终得到的异质性细胞群中肿瘤抗原活化的细胞毒性T淋巴细胞因具有肿瘤特异性，能直接靶向杀伤肿瘤细胞，对肿瘤细胞杀伤活性高等特点，因此是该异质性细胞群中发挥主要抗肿瘤作用的细胞。
[0007]本发明从肿瘤抗原诱导活化的DC细胞与外周血T细胞共培养最终得到的异质性细胞群中将肿瘤抗原活化的细胞毒性T淋巴细胞分离出来，并进行大量扩增，大大增加了抗原特异性T细胞的数量，并提高其杀瘤活性。
[0008]⑶137是一种T细胞活化后表达的膜蛋白，在非活化T细胞不表达，本发明将其作为分离抗原特异性T细胞的表面分子。
[0009]分离后得到的抗原特异性T细胞数量很少，本发明将其进一步高效扩增得到足够数量的细胞用于回输治疗。培养中加入CD137L(CD137-配体)、IL-7，IL-15，IL-2等，⑶137-配体是⑶137的非膜结合型配体，与⑶137结合后，可诱导记忆型T细胞的形成，减少活化诱导的细胞凋亡，从而提高扩增倍数和细胞的杀伤活性；在培养过程中IL-7，IL-15，IL-2的组合使用比单独使用IL-2的增殖细胞要好，且可降低IL-2的使用浓度。
[0010]本发明的具体技术方案是:步骤一:DC细胞培养及肿瘤抗原的负载；步骤二:抗原特异性T细胞的活化和初始扩增培养；步骤三:免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞；步骤四:抗原特异性T淋巴细胞的高效扩增培养。
[0011]优选的，步骤一中，所述DC细胞培养及肿瘤抗原的负载具体包括如下步骤:
[0012]1.1用单采机采集外周血单个核细胞，Ficoll分离后取中间层的细胞，生理盐水洗涤，得到PBMC (外周血单个核细胞)；
[0013]1.2取PBMC，加入(不含血清的基础培养基)配成细胞悬液，接种，培养；
[0014]1.3培养2小时后晃动去除上层杂细胞，留下贴壁的单核细胞(体积比其它细胞稍大)，加入DC培养基，该DC培养基优选的为无血清培养基(含10001 M/ml GM-CSF,10001 M/ml IL-4)，如MP无血清培养基，培养时加入2%自体血浆。
[0015]1.4第4天按照加入肿瘤抗原，肿瘤抗原可以是10 48/!111-111^/1111自体肿瘤细胞裂解物或I μ g/ml-lmg/ml全蛋白抗原；10 μ g/ml-lmg/ml抗原肽，其中抗原肽可以是一种或几种抗原肽的混合。
[0016]1.5第5天，加入DC成熟剂(含LPS、IFN_r，终浓度分别为10ng/ml、50IM/ml)。
[0017]1.6第7天，收集细胞，并将一部分DC细胞冻存。
[0018]优选的，步骤二中，所述抗原特异性T细胞的活化和初始扩增培养具体包括如下步骤:
[0019]2.1将步骤一中最终收集的负载了肿瘤抗原的DC细胞与外周血T细胞按照1:1-1:100的比例混合，用含lng/ml-100ng/ml IL-21的T细胞完全培养基(在RPMI1640培养基中加入 25mmol/L HEPES PH 7.2，1001 M/ml 盘尼西林，100 μ g/ml 链霉素，2mmol/L谷氨酰胺，5.5X 10_5mol/L β -巯基乙醇，10%人AB血清)调整细胞浓度为I X 105_2X 16个/ml，接种，培养。
[0020]2.2第4天，去除一半培养基，并加入相应量含10-20001 M/ml IL-2，1-lOOOng/mlIL-7和l-1000ng/ml IL-15的T细胞完全培养基。
[0021]2.3第7天，去除一半培养基，并加入相应量含lng/ml-100ng/ml IL-21的T细胞完全培养基，再按DC细胞与T细胞的比值为1:1-1:100加入步骤一冻存的DC细胞
[0022]优选的，步骤三中，所述免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞具体包括如下步骤:
[0023]步骤2.3中加入冻存的DC细胞与T细胞共培养24小时后，采用⑶137免疫磁珠(美天妮，货号130-093-476)的方法分离其中被抗原激活的T淋巴细胞(⑶137阳性)。
[0024]3.1计数细胞总数，离心去除上清。
[0025]3.2按每I X 18细胞，加入400 μ I PBS缓冲溶液。
[0026]3.3加入100 μ I CD137-PE，混匀，2-8摄氏度放置10分钟。
[0027]3.4加入1ml PBS缓冲溶液，300xg离心10分钟，去除上清。
[0028]3.5将细胞重悬于800 μ I PBS缓冲溶液。
[0029]3.6加入200 μ I抗PE磁珠，混匀，2-8摄氏度放置15分钟。
[0030]3.7加入1ml PBS缓冲溶液，300xg离心10分钟，去除上清。
[0031]3.8加入500 μ I PBS缓冲溶液重悬细胞。
[0032]3.9将LS柱放在MACS磁性分离器中，用3ml PBS缓冲溶液润洗一次。
[0033]3.10加入步骤3.8所得细胞悬液到LS柱中，收集通过LS柱未标记的细胞到A管中，再用PBS缓冲溶液洗3次(每次使用3ml PBS缓冲溶液)，洗液也收集到A管中，得到未标记的细胞。
[0034]3.11将LS柱从磁性分离器中取出，加入5ml PBS缓冲溶液用推杆将标记的细胞洗出来，用B管收集，得到⑶137+的T细胞。
[0035]优选的，步骤四中，所述抗原特异性T淋巴细胞的高效扩增培养具体包括如下步骤:
[0036]4.1将步骤三得到的⑶137阳性的T淋巴细胞，用50% CM(在RPMI1640培养基中加入 25mmol/L HEPES PH 7.2，1001 M/ml 盘尼西林，100 μ g/mL 链霉素，2mmol/L 谷氨酰胺，5.5X10_5mol/Li3-巯基乙醇，10%人AB血清)和50% AM-V混合培养基进行培养，细胞浓度为1.0X 13-L OX 106/ml，加入下列试剂和因子:异体辐射致死(50Gy)的PBMC(PBMC与 T 淋巴细胞的比值为 10:1-1000:1)、0.01-0.1 μ g/ml OKT3 抗体、10-20001 M/ml IL-2,l-1000ng/ml IL-7、1-lOOOng/ml IL-15 和 l-1000ng/ml CD137-配体。
[0037]4.2第 5 天，去除上清，再加入相应量含 10