对Bt毒素具有杀虫增效作用的小菜蛾碱性磷酸酶基因蛋白片段PxALP1及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属农业微生物学应用技术领域，具体涉及一个具有杀虫增效作用的小菜蛾 碱性磷酸酶基因片段的分离、克隆及其编码的多肽片段在Bt杀虫剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt)在产生芽孢的同时产生一种晶 体包涵体，其体内是δ内毒素的杀虫晶体蛋白，又称Bt晶体毒素。Bt晶体毒素被敏感昆 虫幼虫取食后，在其幼虫肠道碱性环境和蛋白酶的作用下被激活，释放出活性毒素蛋白，后 与幼虫中肠上皮细胞的特异性受体结合形成毒素寡聚体，诱导毒素分子的空间构象发生变 化，多个毒性肽分子在细胞膜中聚集围成外表面疏水、内表面亲水的膜离子通道，进而引起 细胞渗透平衡破坏、细胞吸胀破裂，最后导致肠壁破裂昆虫死亡。
[0003] Bt晶体毒素对靶标害虫具有高度的专一性，是目前世界上产量最大、应用最广泛 的微生物杀虫剂，已广泛应用于微生物制剂和转基因植物中。2012年，在我国126家企业的 生物农药出口中，Bt产值已达1160万美元，与阿维菌素及赤霉酸一起共为8777万美元，占 所有生物农药出口的51 %。Bt杀虫范围包括节肢动物门的鳞翅目（L印idoptera)、双翅目 (Diptera)、鞘翅目（Coleoptera)和直翅目（Orthoptera)等，其对线形动物门和原生动物 门的某些种类亦有毒杀活性。通过各种策略来提高杀虫晶体蛋白的活性，对高效Bt工程菌 的构建和cry基因在转基因植物中的应用具有非常重要的意义。
[0004] Bt杀虫晶体蛋白用于商业性控制农业及卫生害虫已有60余年，自1996年转Bt基 因作物被采纳以来，至2013年，全球转基因作物种植面积达到1. 752亿公顷，其中印度Bt 棉花种植面积创历史新高，达到1100万公顷，采用率为95%;中国小农户种植了 420万公顷 的Bt棉花，采用率为90%;五个欧盟国家Bt玉米的种植面积达到创纪录的148013公顷，比 2012年增加18942公顷。Bt作物的合理轮作及抗性管理是十分必要也是各国一直关注的 问题，Bt抗性持续的增长，则可能无法控制某些重大病虫害的发展，造成难以估计的损失。
[0005] 而Bt杀虫蛋白增效物质的研宄则能更好地促进其杀虫效率，减少农药使用量，延 缓抗性的产生。除杀虫晶体蛋白和外毒素起杀虫作用外，还有许多与杀虫相关的增效物 质，如几丁质酶、Cyt 蛋白、营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs)、 辅助蛋白（Accessary proteins)P19、P20、P21 和 Zwittermicin A 等。近年来，经研宄还 发现妈粘蛋白片段（Cadherin)、氨肽酶氮（Aminopeptidase N)及碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase)等均能增强Cry毒素对昆虫的杀虫活性。按增效物质作用机理不同，可将其 分为三类：1.改进毒素的锚定和膜的插入，如Cyt蛋白、氨肽酶氮及碱性磷酸酶等；2.通过 破坏昆虫中肠的围食膜来增加毒素的通透性，如钙粘蛋白片段等；3.破坏对昆虫生长所必 须的细菌中肠免疫性，分解作为昆虫的中肠围食膜、上皮，破坏幼虫这道天然屏障，使病毒、 细菌等更容易侵入幼虫体内，引起幼虫死亡，如几丁质酶、Zwittermicin A等。此外，通过 对毒素基因进行改造或对其进行定点突变，在Cry蛋白的特定区域引入水解位点或者删除 N末端片段等方面的改造也可达到增效目的。
[0006] 碱性磷酸酶作为CrylA毒素的受体，可促进毒素对膜的插入和孔道形成。诸多从 双翅类和鳞翅类昆虫物种中分离出来的碱性磷酸酶已被鉴定为CrylAc和CryllAa毒素的 受体。陈文波等的研宄表明，棉铃虫（EU729323)中肠碱性磷酸酶多肽对CrylAc毒素具有 一定的增效作用。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在于针对鳞翅目昆虫对Bt抗性强的现状，提供一种对Bt毒素具有杀虫 增效作用的小菜蛾碱性磷酸酶基因蛋白片段PxALPl及应用，本发明从小菜蛾体内克隆了 一种新型的增效因子碱性磷酸酶片段PxALPO，通过原核表达与毒力测定，表明该碱性磷酸 酶片段PxALPO编码的多肽片段具有显著提高Bt晶体蛋白杀虫活性的功能。
[0008] 为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种对Bt毒素具有杀虫增效作用的 小菜蛾碱性磷酸酶基因蛋白片段PxALPl，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0009] 本发明同时提供一种编码上述蛋白的基因 PxALPO,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0010] 上述提及的碱性磷酸酶基因片段从小菜蛾（PlUtella xylostella)中克隆（申请 人将其命名为PxALPO)。经过测序发现该PxALPO由967个碱基组成，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。序列分析发现本发明的PxALPO编码了由322个氨基酸残基组成的多肽片段 PxALPl，该多肽序列如SEQ ID No. 2所示。通过原核表达及室内毒力测定发现本发明的基 因 PxALPO原核表达后的PxALPl蛋白，可显者提尚CrylAc杀虫晶体蛋白对小采蛾的杀虫活 性。
[0011] 本发明的碱性磷酸酶片段PxALPO可用于转化微生物等，使之表达出具有增效作 用的多肽PxALPl，从而可显著提高杀虫晶体蛋白的杀虫活性，并可克服或延缓小菜蛾等鳞 翅目害虫对Bt制剂或Bt转基因植物的抗性，在鳞翅目害虫的防治方面具有极为广泛的应 用价值。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明实施例中PCR的琼脂糖凝胶电泳图；
[0013] 其中，M :100bp plus DNA Ladder分子量标准，1 :碱性磷酸酶基因片段PxALPO的 PCR扩增产物。
[0014] 图2是本发明实施例构建的克隆载体PxALP-Tl的物理图谱。
[0015] 图3是本发明实施例中超量表达载体PxALP_6p的构建图及其物理图谱。
[0016] 图4是本发明克隆的碱性磷酸酶基因片段PxALPO的原核超量表达产物（PxALPl) 经纯化后的SDSPage电泳图；
[0017] 其中，M:15-150kDa双色预染蛋白标准；1:空载体pGEX-6p-l表达菌株PGEXO诱导 培养物中亲和层析纯化的GST蛋白；2 :PGALP菌株诱导培养物裂解后上清中的GST融合蛋 白；3 :吸附后上清中的GST融合蛋白；4 :第一次洗涤后上清；5 :第二次洗涤后上清；6 :第 三次洗涤后上清；7 :纯化后的GST-PxALPl融合蛋白。
[0018] 图5是本发明实施例中增效蛋白PxALPl与杀虫晶体蛋白配比后生物测定结果分 析图。
[0019] 其中，横坐标为不同处理，图中不同的字母表示各处理之间在0.01水平上差异显 著。
【具体实施方式】
[0020] 以下仅为本发明的实施例，对本发明具有说明作用，但无限制作用。有关DNA的标 准操作方法和所使用的药品均参考《分子克隆实验指南》所描述的内容（参见J.萨姆布鲁 克等，2002,分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等（译），科学出版社，北京）。本发明中所 涉及的其它各种实验操作，均为本领域的常规技术。
[0021] 实施例1小菜蛾碱性磷酸酶基因片段PxALPO的克隆
[0022] 本发明以小菜蛾幼虫作为碱性磷酸酶基因片段PxALPO的来源。
[0023] 1、小菜蛾幼虫中肠总RNA的抽提及检测
[0024] 所用小菜蛾为CrylAc-S敏感品系，于室内饲养多年，期间从未施用过任何杀虫 剂。取3龄健康小菜蛾幼虫数头，取中肠，按照TRIzoL抽提法提取小菜蛾幼虫中肠总RNA， 具体步骤如下：
[0025] (1)用镊子将所有中肠转移至预冷的研磨器中，加入适量Trizol (TaKaRa，），后在 冰上研磨成匀浆。
[0026] (2)涡旋混匀后室温静置5min，12000 X g 4°C，离心5min，然后将上清液转移至新 的I. 5mlEP管中。
[0027] (3)加入l/5Trizol体积量预冷的氯仿，震荡混匀，室温下静置5min，12000Xg 4°C，离心15min，将上清液转移至新的EP管中，注意不要吸入杂质。
[0028] (4)在上清液中加入等量体积预冷的异丙醇于室温静置10min，12000Xg4°C，离 心 IOmin0
[0029] (5)将上清弃之，向沉淀中加入与Trizol等体积预冷的75%的乙醇，涡旋混匀清 洗沉淀，12000Xg 4°C，离心 5min。
[0030] (6)弃上清保留沉淀，让其空气自然干燥或真空干燥数分钟。
[0031] (7)加入适量的DEPC水溶解沉淀，用枪头反复吸打混匀。
[0032] 测定0D260/0D280的比值为1. 9-2. 0之间，每个样品重复测定3次，结果显示抽提 的RNA的浓度为3436. Ong/ μ 1，说明抽提的总RNA纯度符合实验要求，样品存于-80°C备 用。
[0033] 2、反转录PCR扩增获得碱性磷酸酶基因片段PxALPO
[0034] 合成cDNA采用的是TaKaRa公司的反转录试剂盒（TaKaRa)，按照说明书的方法加 入 1-5 μ g 模板 RNA、1 μ I Oligo dT Primer (50 μΜ)、1 μ I dNTP MixtureQOmM each)，加 RNase free dH20补足至10μ1。吸打混匀后置于65°C温育5min，立即置于冰上冷却。然 后在该体系中加入4μ1 5XPrimeSctipt II Buffer、0.5yl RNase Inhibitor(40U/yl)、 I μL PrimeSctipt II RTase (20〇υ/μ1)，加 RNase free dH20 补足至 20 μL。温和地混匀， 45°C温育45min后于70°C处理15min，迅速置于冰上，检测后存于-20°C备用。
[0035] 获得小菜蛾中肠 cDNA第一链后，根据己发表的棉铃虫中肠碱