一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程及蛋白纯化技术领域，具体涉及一种rhIL-ΙΟ重组载体构建及其蛋白提纯的方法。
【背景技术】
[0002]在体外将目的基因与载体结合成一具有自我复制能力的重组体，继而通过转化大肠杆菌，筛选出含有目的基因的转化子细菌，再进行扩增、提取获得大量同一 DNA分子拷贝，即重组克隆或表达载体的构建。构建完毕的质粒可进行酶切及测序鉴定，得到与目的基因相符且没有突变的重组载体，将其转化大肠杆菌感受态进行诱导表达。蛋白诱导表达后进行分离纯化，鉴于rhIL-ΙΟ在非融合系统中表达量低或不表达，因此后期采用融合系统进行诱导表达，并成功创新性的利用了 IMPACT表达系统，分离纯化得到rhIL-10。
[0003]白细胞介素1(ILlO)是由多种细胞产生并作用于多种细胞的免疫调节细胞因子，其功能包括免疫抑制和免疫促进两方面，可调节多种免疫细胞的分化和增殖，同时也具有调节免疫刺激的特性。
[0004]RGD多肽(⑶CRGDCFC，9肽)能够特异性结合在成体中相对缺乏的ανβ3、ανβ5整合素，此两种整合素在血管发生中会选择性上调升高，因此，RGD是新生血管内皮细胞特异性识别并结合的多肽序列。将新生血管内皮特异性结合的RGD导向肽与IL-10融合表达，可以降低用药剂量及治疗成本，减用药带来的毒副作用；同时在体内能够使IL-10药物定向作用于血管内皮细胞而发挥药理作用。
【发明内容】
[0005]为克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种rhIL-ΙΟ重组载体构建及其蛋白提纯的方法，建立了适宜重组蛋白rhIL-ΙΟ的表达载体，并利用此表达载体进行目的蛋白的纯化，检测其具有生物活性；该重组蛋白增加了 hIL-ΙΟ在体内的靶向性，赋予了蛋白具有抗肿瘤以及机体免疫功能的活性，更为重要的是其在伤口愈合过程中能够与新生血管内皮细胞特异靶向结合，从而预防抑制瘢痕纤维化的形成。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:一种hIL-ΙΟ重组载体，其特征在于，采用MPACT系统表达，其融合蛋白标签为6个组氨酸^XHis)的重组载体，如重组载体的质粒图谱所示。
[0007]一种hIL-ΙΟ重组载体的构建、表达及鉴定方法，包括以下步骤:
[0008]( 一 )rh-1L10 基因的扩增
[0009]I)总RNA的提取
[0010]正常人外周血经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗涤2次，重悬于10%PRMI1640培养液，加入终浓度为10g/L的ConA，置5% 0)2培养箱，37°C培养48h，收集细胞，根据Sigma RNA抽提试剂盒方法，提取总RNA，_80°C保存备用；
[0011 ] 2) RNA反转录及IL-10 cDNA的扩增
[0012]利用Takara公司反转录试剂盒，按照说明进行RT-PCR反应:第一步去除基因组DNA，5XgDNA Eraser Buffer 2 μ I, gDNA Eraser I μ I, Total RNA 500ng, Rnase FreedH20 加至 10 μ 1，42°C温育 2min ;第二步反转录，分别加入 PrimeScript RT Enzyme MixI I μ I, RT Primer Mixl μ 1，5XPrimeScript Buffer 24μ1，第一步反应液 10 μ 1，RnaseFree dH20 加至 20 μ 1，37°C温育 30min，85°C反应 3min 后得到 cDNA。
[0013]( 二 )重组载体的构建、表达及其鉴定
[0014]l)pTWINl-1L10表达载体的构建
[0015]按大肠杆菌惯用密码子设计RGD基因序列、引物及相应的酶切位点，合成如下2条引物F1、R1 ；
[0016]RGD 导向肽氨基酸序列如下:H2N-Cys Asp Cys Lys Gly Asp Cys Phe Cys-COOH ；
[0017]RGD 基因序列:5’ tgt gat tgc cgt ggt gat tgt ttc tgt 3’ ；
[0018]Fl:5' GCTCTTCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAG3' BspQI
[0019]Rl:5' CTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACGGCAATCACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3' PstI
[0020]以Fl、Rl 为引物，cDNA 为模板，随之按 95°C 1s 预变性，95 °C 30s, 55 °C 30s，72 °C Imin，30个循环后72 °C进行延伸5min，得到PCR产物，产物及pTWINl载体分别经BspQI/Pst I双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化DH5a，挑取单克隆，抽提质粒，进行酶切和测序鉴定，得到pTWINl-1LlO-RGD表达载体；
[0021]2)pTWINl-his-1L10 表达载体的构建
[0022]带有his标签his-1L10-R⑶扩增引物:
[0023]F2:5’ CGCAACATATGCATCATCATCATCATCATAACAACGGTAACAACGGTCTCG3’ NdeI/6 Xhis
[0024]R2:5，AACTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACG 3，PstI
[0025]以F2、R2为引物，pTWINl-1LlO-RGD为模板，随之按95 °C 1s预变性，95 0C 30s,60 °C 30s, 72 °C 1.2min，30 个循环后 72 °C 进行延伸 5min，得到 PCR 产物，产物及pTWINl-1L10-RGD载体分别经Ndel/PstI双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化Rosetta，挑取单克隆，抽提质粒，酶切鉴定，进一步经测序鉴定，构建成pTWINl-his-1LlO-RGD表达载体的工程菌；
[0026]3)rhIL-10重组蛋白在大肠杆菌中的表达
[0027]上述工程菌pTWINl-his-1L10-RGD/Rosetta接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C震荡培养过夜，次日以1% (v/v)的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素发酵培养基中，继续在37°C震荡培养至对数生长中期，培养液光密度0D600为0.6时，加入ImM IPTG继续培养5hr诱导表达，离心收集菌体；
[0028]4)rhIL_10蛋白表达的检测及鉴定
[0029]将诱导表达的菌体培养物离心，收集菌体，采用12%的SDS-PAGE电泳分析表达产物，IPTG诱导与未诱导样相比，在分子量相应处有一条明显的深染新生蛋白带，与预计融合蛋白的分子量大小相符。将蛋白从凝胶电转移至PVDF膜上，常规Western blot分析，ECL发光，可见一明显显色带，分子量一致，未诱导菌株，标准蛋白及表达菌中其它条带无阳性反应。
[0030]rh-1L10融合蛋白的纯化方法，包括以下步骤:
[0031]I)融合蛋白 his-1ntein-1L10-RGD 的粗提
[0032]取诱导表达的菌体20g，用 200ml 裂解液(1mM Tris-Cl, pH8.5 ；lmM EDTA, pH8.0)，磁力搅拌器充分搅拌15min后，加入200 μ I溶菌酶(50 μ g/ml)，充分搅拌15min，4°C静置Ihr，取样50 μ 1，12000rpm离心5min，上清中加入2 X 1adingbuffer混勾，沉淀中加入 50 μ I ddH20 重悬，加入 2 X loading buffer 混勾。废水煮 5min，12000rpm 离心 5min，经SDS-PAGE检测发现表达的融合蛋白存在于沉淀中，说明诱导表达的重组蛋白是以包涵体形式存在的；
[0033]2)包涵体洗涤
[0034]第一步，加入0.1% (w/v)脱氧胆酸钠(DOC)，继续加入ImM MgCl2，加入2.5 μ g/ml DNA酶(Dnase I)，磁力搅拌器充分搅拌20min，取样50 μ I后静置lOmin，4°C离心，12000rpm/min，离心 20min，弃上清；
[0035]第二步，加入200ml裂解液，0.5% DOC(w/v)进行洗涤，磁力搅拌器搅拌15min，取样 50 μ I 后静置 lOmin, 4°C离心，12000rpm/min,离心 20min，弃上清；
[0036]第三步，加入200ml裂解液，0.5% Triton Χ-100 (v/v)，磁力搅拌器搅拌15min，取样 50 μ I 后静置 lOmin, 4°C离心，12000rpm/min,离心 20min，弃上清；
[0037]第四步，重复上一步操作；
[0038]3)包涵体溶解
[0039]第一步，400ml溶解液(0.1M Tris-Cl (pH 10.0) ,0.1M NaCl，8M 尿素，1mM 2-巯基乙醇(β -ME))溶解包涵体，磁力搅拌器搅拌1.5hr，4°C静置过夜；
[0040]第二步，将上述溶解液12000rpm离心20min，收集上清；
[0041]第三步，将上清装入透析袋，用pH8.0溶解液不含β -ME透析24_36hr，换液2_3次，离心收集上清；
[0042]4)融合蛋白 his-1ntein-1L10-RGD 的纯化
[0043]取GE 公司镇柱基质 NI Sepharose Fast Flow 装柱，柱体积 5.4X 15cm，用 ρΗ8.0溶解液不含β -ME平衡，上样后分别用含0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3Μ咪唑ρΗ8.0溶解液线性梯度洗脱，收集各个峰样品，SDS-PAGE鉴定；
[0044]5)融合蛋白his-1ntein-1L10-RGD的复性及自切割
[0045]于4°C时，在复性缓冲液的逐渐稀释下缓慢复性，在pH6.0缓冲液中融合蛋白his-1ntein-1L10