暗褐网柄牛肝菌ssr分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及暗褐网柄牛肝菌SSR分子标记，具体涉及暗褐网柄牛肝菌的简单重复序列(SSRs，Simple sequence repeats)分子标记，属DNA分子标记技术领域。
【背景技术】
[0002]简单重复序列(SSRs，Simple Sequence Repeats)，又叫做微卫星位点(Microsatellites)，是由I ~ 6 bp的重复单元串联重复而成的序列(Sharma et al.2007)。它们在原核、真核基因组中广泛分布，在基因编码区及非编码区都能找到(Li etal.2004)。作为分子标记，SSR有许多优点:在整个基因组中分布广泛、均匀且数量充足，因而多态性很高；SSR标记呈孟德尔共显性遗传，可以区分纯合、杂合基因型；PCR扩增仅需要少量DNA，且对DNA的质量要求不高。近年来还发现SSR在基因组中可能发挥着一些功能，例如影响基因调控、基因组系统组成等。因此从基因组水平上了解SSR的分布是非常重要的。传统获得SSR标记的方法需通过建立、筛选基因组文库、克隆测序、引物设计等一系列实验，耗费许多人力、物力。而现在，随着基因组测序越来越便捷，由基因组数据中直接开发SSR标记的方法也被运用得越来越多。
[0003]暗褐网柄牛肝菌(/%76^ο/7?5.Poriefl11SW1S)是云南南部及泰国北部最受欢迎的野生食用菌之一。在脱离宿主树，接种于人工培养基的情况下，暗褐网柄牛肝菌在菇房中经过约3个月时间培养，能够完成整个生活史，形成子实体，是目前牛肝菌目中唯一一个担孢子、菌丝体在实验室条件下能够萌发、生长、交配，并实现温室栽培出菇的物种。作为刚刚开始被人工栽培的物种，暗褐网柄牛肝菌生物学、生态学的研宄基本上还停留在现象观察的程度上，能用的特异性分子标记缺乏，对它的遗传多样性、群体遗传学方面的特性更是几乎一无所知。利用上述方法，开发SSR分子标记，能对其遗传多样性，群体遗传学及种质鉴定进行研宄，对将来新品种的开发，种质资源的评价，栽培技术的创新突破都具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于，根据目前暗褐网柄牛肝菌研宄的需要，开发具有多态性的暗褐网柄牛肝菌SSR分子标记，建立技术体系，弥补其特异性分子标记的空白，为其遗传多样性，群体遗传学及种质鉴定研宄提供有力的研宄工具。
[0005]本发明的技术方案为:在已经获得暗褐网柄牛肝菌基因组数据的基础之上，利用常规生物信息学方法，在基因组水平上检测其SSR的分布，进行引物设计，利用来自西双版纳地区的暗褐网柄牛肝菌样品，选取部分引物进行初筛、复筛后，得到15个具有多态性的 SSR 分子标记，其编号为:ΡΡ50097、ΡΡ64100、ΡΡ32087、ΡΡ85099、ΡΡ80085、ΡΡ56123、ΡΡ76127、ΡΡ57130、ΡΡ39117、ΡΡ60130、ΡΡ93120、ΡΡ23157、ΡΡ45160、ΡΡ30156、ΡΡ48147。
[0006]上述SSR分子标记的核苷酸序列分别为:
ΡΡ50097 (143 bp),由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成:ACCAAGTTTTTCCCCACTCCCTTCTCAAAGCCCCCTTCACCCACTTACTTACGAGGGCCGGCGGGAGCAATTCAAGATGGTAGGGTGATATTTCACCAGATCGCGTGAGCTCATACGACCCTGTGTACTGCCATTCGTTGGCC ；PP64100 (312 bp),由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成:
ATGTGATGATGAAGTCAAGCAGCAGTCGATGAGGTGGGAGATTGTCATGTTGTGAGTGCACATGTGTGTGACAAGCAGCAGTCGAGGGGGTGAGGGATTGCCATGCATCATTGATGGAATTGAGTGCGTGTGTCATGAGTGCGTGTGCCGGTGTGTGTGTGTGACAAGCAGCAGTAAAGGGGGTGGGGGATTGCCATGTTGGTGATGCCATCGAACAGGTGGGTCGTGAGCGTGCATGCATGCGTGCCGTGAACATCGAGGGGGTGGGGGATTACCATGCATCGTCGATGAAATCGAGTAGGTAGGTCGTGA ；
PP32087 (143 bp)，由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列组成:
TAGTATTGTGGTGGTCATGGTGATCATTGTTGTCAATGTAGAGTCATGGTGGTCATGTTGACATGGTCATCATTGATGTTGCAGTCATGGTCATTGTGGGTGTGCATCATCCCAATATTGTGGTGCACAGGTATTGTCATCAA ；PP85099 (143 bp)，由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成:
TCGTGTTGCCATGTGAGGGTGTGTTTCATCCAGTTTTCGTCGTCACGCTTGTTGGTGGAGTATGTTAGATGGAAGAAAAGGATGAAGCGGATGTGAAAGACAGACCTCGGGATAGTCTTCGCGTGCGTGGGCACCACGAGATT ；PP80085 (143 bp)，由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列组成:
CACCACCACCACCACCACGACGTGAATGACGACGACGACCATCACCATCACCATCATCACCACGACGCGAACGAGAACGACGGCGACGACGACTACCACCACGACCACCACGCAAACGACGACAACGACTACTACGACTACCA ；PP56123 (349 bp),由SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成:
TGATCAACGTCCCTCTCGGTGGTAATGTACGACGACCTCCATACGTATCCGAGTCGCGTAAGTCTTCACCCCATGCAGTACGTATGCACAAGTAAGCGACGACTTCTTGCGAGACGTCGGAGCCGTTCTGGATCAGCCTTTCCGAGGACTTGATGATGATGATGATCGTTGCGTTGCGTTGGGGTTTCAAGTTATCAGATTATGTATGTAAGCGTGCGTAGATAGAATGTGGCGCATCCGCACCGCCATCGGATTGGAGAGTTGTTTCCTTTTTCTTCCACTTGTTCCCGTCCCCGCTCCCCCTATGTCATGCAG ；
PP76127 (143 bp)，由SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列组成:
ACTGCAGCGCTTGAGAAACCGTTGAATAAACCCCGGTTATAGGCGCAGACCGAAGAGACATGTTTGAACGTGCTAGATCGAGAGCCTGGCCGTGCCTCGCGGCATCTGTCGACATCTGACTCGCATCCAACTGAACGTCCGCA ；PP57130 (143 bp),由SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成:
CATTGATGGCAGTGACCCCTGGACTTGAGGGCAGCGACATGACAACAACAGCAATGATAGCAATGACAGCATATGGCCACCTTGTATCACCATCATCACCATGACCATCACACGATAATGACAATGACCTTGGCCATCACCAC ；PP39117 (318 bp)，由SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列组成:
AGGCGCGTTGGATCGAACGTCGTGAACGTCGTCGTCGTCGCCGTCGAGGTGAGCCGTGCACTGTGCTGTCTATGCATGTCTGCTCTACTCTAGTGTCCGTTGTTTGATTATTCCGCATCTCTGCGATGGCGATGGCGATCACGCGTTATTATCATCATCATCATCATCCGTCCGTCCGTAAACTACAAGTGGACTTTGGACTTTGGATTGCTGATATCCATCCATCATCATGTTATTTATCTAGATAAACGAGTCTTTACGCGCTTGTTGGATACGCCGGTTTTAGAGGTCTCCGAGTCGGAGGGGGAGGCGGAGGAG ；
PP60130 (312 bp)，由SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列组成:
AAACTAGCACTTACGCCGAACACCTTCCGGTCCTCGAGGATGTCACAGAGCGCGAGCAGGAATGTTTGGAT
GGGTTTGAGAGCCCTTCTTGCTCAGATTTTGGAGAACGCAACGCGAAGCCGTCTCTCTCCGTGTCTGCATCAATGG
CGGTCTCTCTCTCTCCATCCGTTGCTTCATCCATCACAGCGGCGGGACTCGAGATAATGAGGATGGATGCCGACGCCCAGGAACGCGCGCGGGAAAAGGAGAGAGAACGCGAAAGGGCTCGCGAGAGAGAACGTGAAACAAGGAAGGAGGGACAACACCAGCGCA ；
PP93120 (312 bp),由SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列组成:
GGACGTTTCTTAAAAGTCATGATAATGTTTAGCCTTCTGAGTTCTCATATCCAGATTGACATGTTATGTTCCAGTTGAAAACGAAGACATTGGGAGAAGGGGACCAATGATGGAAATCAAATAAATAACGCCGACATGGACATTTACCCCGCAGCAGCAGCAGCCCCGCTTGTGGCCAGCTTCTCACTGTAGCCCTGCGAAACAATCTCATTGACCTTATTTAGTGTCTCGAAACTCTCAGATGACGCTAATCGCCAACGTGGTCGGAGAAAACGACCCAAGTGACCAGATTCCATGTGCAGCTTCTGAAGT ；
PP23157 (143 bp)，由SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列组成:
ACAGTGACGACAGCCATGGCCACCACTGTACCATCATGACCATGGCATCACGACAACGACTACGACAACAACAGCGACGACCATGATGACCACTACCACAACCACGACGATGCGAATGACGATGACAACGACAACTACCACTG ；PP45160 (312 bp)，由SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列组成:
ACGCAACCATCTCCGTTCACTCCCGGCACCCACTTATCGCTCTTCCAGCCCCGTCTACGAGTACCCACTCAATGGCCAGTGGATCATGATGGACATCGACGACGGTTACATCCTCTGGACTGGCATCTGGAAAGGTATCCCTTGTCCTTCTCGTCGTCGTCGTTCTCCAGCTGATGACCTCTCCAGCCCTTGGCAATTCAAAAGGTATGCTCCGCCTCTGACTGCGGCGCGCGCCATGTCAACGCCACTCCTTACAGCTGATATCGTCAAGATGATCGATTCGCAGCCCGACTTGGCACCTGTTATCCGTCG ；
PP30156 (312 bp)，由SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列组成:
AGTTTTCTGACTGGCATGCATTCAGATTCTCCCTTAGAGAACCGTCCATAATATTGATGGTATGCGCTAGGCACCATCTCTTCTATAGTCTTTTCAAGCTTAGGAGGCGCCTCGATATTAGCACATATTGCATAGGCATGGTAGGCAGCCTCTTCTTCTTCTTTTTCCAAAACACGTAGGAATACACTCCTTTCCTTTAATAGATGGCAGCTTCTAGGGCACCTCGTCATCTTGACTTCGCCTTTAGACCAATCTATTTCGGGATTGTGCTTCTTTAGCCATGTGTAACCAAGGATGATCTGGTTACGTCCT ；
PP48147 (143 bp)，由SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列组成:
GCTGTCCGAGATAAGATAAGATAAAGGGACTTAGACGTTTCTAAGTCAAAGGTCGTCAAATAATAGTGGAAAAATAGGGAAAAAAGTCATATCGTAACACATAGTACTAACACTATACCAACATATACTAGTCAGAGTCAGCA ；
上述SSR分子标记的引物序列分别为:
PP50097-F:ATACGACCCTGTGTACTGCCATTC ；
PP50097-R:AGTGCGATG