一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种快速准确的鉴定进出口海鱼中的异尖线 虫幼虫的方法。
【背景技术】
[0002] 异尖线虫病（Anisakiasis)是由于人食入寄生在海鱼体内的异尖线虫科某些种 的活的第三期幼虫而引起的疾病，可表现为急腹症症状及过敏性症状。该病呈世界性分布， 给人类健康构成严重威胁，是一种重要的人兽共患寄生虫病，也是我国禁止入境的二类寄 生虫病。全球的人体感染病例已达3万多例并呈上升趋势。我国对此病报道极少，一方面 和我国由异尖线虫引起过敏的情况较少有关，另一方面与我国居民大多不喜生食食物习惯 有关，但随着吃海鲜、生鱼片等饮食时尚的兴起和渔业、旅游业的发展，异尖线虫病可能出 现在我国生食海鱼的人群中。
[0003] 在日本、荷兰、英国、法国、德国以及太平洋地区等20多个国家有异尖线虫幼虫寄 生与人体消化道各部位的报道，其中日本已报道人体病例14000余例。主要是这些国家居 民喜吃腌海鱼或喜吃生拌海鱼片、鱼肝、鱼子或乌贼作佐酒佳肴，由此获得感染，使该病成 为一种海洋自然疫源性疾病。我国尽管迄今尚未见有病例报告，但在国内市售海鱼中，发现 鲐鱼、小黄鱼、带鱼等小型鱼体肌肉或器官组织内的异尖线虫幼虫感染率高达100% ;从东 海和黄海获得的30种鱼和两种软体动物发现带幼虫率为84%，可见我国人群感染异尖线 虫病的潜在危险性很大。
[0004] 由于异尖线虫对人类健康的严重危害，该虫一直是我国出入境口岸检疫的传染 病、寄生虫病病原。近年来，随着进出口贸易的快速发展，我国从国外进口越来越多的水产 品。为确保这些水产品的安全，必须对异尖线虫等传染性病原进行检疫。目前，口岸动物检 疫部门对异尖线虫幼虫的分类鉴定主要依靠形态学观察。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于现有对异尖线虫幼虫的分类鉴定主要依靠形态学观察，效率低 下，错误率高的缺陷而提供一种快速准确的鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法。 [0006] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，所述方法包括如下步骤： a) 获得虫体样本：剖检进出境海鱼内脏表面和消化道而获得异尖线虫幼虫虫种，放入 75 %的酒精保存备用； b) 样品总DNA的制备：将步骤a)得到的酒精中保存的异尖线虫幼虫用蒸馏水洗净 后剪碎，加入500yL消化液，55°C作用12-20h，苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀DNA，测定浓度后 置-20°C保存； c) rDNA-ITS区PCR扩增：以步骤b)得到的DNA为扩增模板，用针对异尖线虫rDNA保 守区的引物： NC5 :5' -GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3'（SEQIDNO. 1)和NC2 ：5, -TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3,(SEQIDNO. 2) 进行PCR扩增，目的片段为898-956bp; d)PCR产物酶切分析：根据已在GenBank注册的异尖科线虫ITS序列，经DNASTAR软件 分析，将步骤c)得到PCR产物用HinfI和HhaI限制性内切酶进行RFLP分析，得到结果。
[0007] 作为优选，步骤b)中的消化液配方如下：5MNaCl12. 5yL;0.lMTris-HCl(pH= 8.0)50yL;0. 1MEDTA(pH= 8.0)125yL;10%SDS100yL;20mg/ml蛋白酶K2.5yL，蒸馏 水 210yL〇
[0008] 作为优选，步骤c)中PCR扩增体系为50yL，其中：2yL模板DNA，10XPCR bufTer5tiL，25mmol/LdNTP3yL，25mmol/LMgCl2 3yL，20iimol/L引物各 0.75yL， 0? 5yLTaq酶，用双蒸水补足至50yL;扩增条件为：95°C预变性5min，95°C变性30s，54°C 退火30s，72°C延伸80s共35个循环，最后72°C延伸7min;产物4°C保存，将扩增的产物用 1. 5 %琼脂糖进彳丁电泳检验。
[0009] 作为优选，步骤d)中，用Hhal酶切，反应体系如下：PCR纯化产物10yL， Hhal(10U/yL)lyL，10XMbuffer2yL，灭菌双蒸水补足至 20yL;用Hinfl酶切，反应 体系如下：PCR纯化产物 14yL，HinfI(10U/yL)1.5yL，10XHbuffer2yL，灭菌双蒸水 补足至20yL。
[0010] 作为优选，步骤d)中，用HhaI与HinfI酶切，反应体系如下：PCR纯化产物 12yL,HhaI(10U/yL)0.8 yL,HinfI(10U/yL) 1yL, 10XMbuffer1. 5yL，10XH buffer1.5yL，灭菌双蒸水补足至20yL。
[0011] 作为优选，酶切温度37°C，水浴消化6h，酶切产物用1. 5%琼脂糖进行电泳检验。
[0012] 本发明的有益效果：本发明利用异尖线虫幼虫总DNA为模板，用PCR扩增方法得到 898-956bp大小的特异片段，利用DNASTAR软件对异尖线虫的ITS序列进行分析，选择两个 限制性内切酶HinfI和HhaI对异尖线虫的ITS序列进行酶切分析，分析结果显示本发明 方法判断准确，操作步骤简单，成本低、稳定性好。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明异尖线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增图。图中，M，100bpDNALadder Marker; 1-5,A、B、C、D、E样品。
[0014] 图2是本发明异尖线虫rDNA-ITS序列的PCR产物HinfI酶切检测图。图中，M， 100bpDNALadderMarker;1，空白? 2，A.pegreffii. 3，A.typica. 4，A.simplexss. 5， Pseudoterranovadecipiens. 6,A.physeteris〇
[0015] 图3是本发明异尖线虫rDNA-ITS序列的PCR产物HhaI酶切检测图。
[0016] 图中，M，100bp DNA Ladder Marker;1，A. typica. 2，Pseudoterranova decipiens. 3, A. physeteris. 4, A. pegreffii. 5, A. simplex s s.〇
【具体实施方式】
[0017] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施例并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将 落入本发明保护范围。
[0018] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0019] 10XPCRBuffer、dNTP、Taq酶和限制性内切酶HinfI和HhaI均为大连宝生物 公司产品。
[0020] 实施例1 一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，所述方法包括如下步骤： a) 获得虫体样本：剖检进出境海鱼内脏表面和消化道而获得异尖线虫幼虫虫种，编号 八、8、(：、03放入75%的酒精保存备用； b) 样品总DNA的制备：将步骤a)得到的酒精中保存的异尖线虫幼虫用蒸馏水洗净 后剪碎，加入500yL消化液，55°C作用12-20h，苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀DNA，测定浓度后 置-20°C保存；消化液配方如下：5MNaCl12. 5yL;0?lMTris-HCl(pH= 8. 0) 50yL;0? 1M EDTA(pH= 8. 0) 125yL;10%SDS100yL;20mg/ml蛋白酶K2. 5yL，蒸馏水 210yL; c) rDNA-ITS区PCR扩增：以步骤b)得到的DNA为扩增模板，用针对异尖线虫rDNA保 守区的引物： NC5 :5' -GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3'（SEQIDNO. 1)和NC2 ：5, -TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3,(SEQIDNO. 2) 进行PCR扩增，目的片段为898-956bp;PCR扩增体系为50yL，其中：2yL模板DNA， 10XPCRbuffer5yL，25mmol/LdNTP3yL，25mmol/LMgCl2 3yL，20ymol/L引物各 0. 75yL，0. 5yLTaq酶，用双蒸水补足至50yL;扩增条件为：95°C预变性5min，95°C变性 30s，54°C退火30s，72°C延伸80s共35个循环，最后72°C延伸7min;产物4°C保存，将扩增 的产物用1. 5%琼脂糖进行电泳检验； d)PCR产物酶切分析：根据已在GenBank注册的异尖科线虫ITS序列，经DNASTAR软件 分析，将步骤c)得到PCR产物用HinfI和HhaI限制性内切酶进行RFLP分析，得到结果。 用扭^1酶切，反应体系如下屮0?纯化产物1〇1^，扭^1(1(^/1^)11^，10\]?131^作『 2 1^，灭菌双蒸水补足至2〇1^;酶切温度37°0，水浴消化611，酶切产物用1.5%琼脂糖进行 电泳检验。
[0021] 实施例2 一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，所述方法包括如下步骤： a) 获得虫体样本：剖检进出境海鱼内脏表面和消化道而获得异尖线虫幼虫虫种，编号 八、8、(：、03放入75%的酒精保存备用； b) 样品总DNA的制备：将步骤a)得到的酒精中保存的异尖线虫幼虫用蒸馏水洗净 后剪碎，加入500yL消化液，55°C作用12-20h，苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀DNA，测定浓度后 置-20°C保存；消化液配方如下：5MNaCl12. 5yL;0?lMTris-HCl(pH= 8. 0) 50yL;0? 1M EDTA(pH= 8. 0) 125yL;10%SDS100yL;20mg/ml蛋白酶K2. 5yL，蒸馏水 210yL; c) rDNA-ITS区PCR扩增：以步骤b)得到的DNA为扩增模板，用针对异尖线虫rDNA保 守区的引物： NC5 :5' -GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3'（SEQIDNO. 1)