一种同步鉴别动物源性成分的pcr方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肉及动物产制品中动物源性成分鉴定的检验技术领域，具体涉及一种 利用线粒体DNA鉴定山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛源性成分的PCR方法及试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 动物源性成分鉴定源于对动物饲料中添加牛羊成分的检测。1985年英国发生"疯 牛病"，并在随后的几年里传播至欧洲多个国家和地区。"疯牛病"不仅给这些国家带来经 济损失，还带来政治上的危机。后来研宄证明，饲料中添加的含有"疯牛病"致病因子朊蛋 白的牛羊源成分是传播该病的重要媒介，因此世界各国明令禁止在饲料中添加牛羊源性成 分，并对此进行严格检测。如今，随着社会经济的发展，肉类及其产制品已经成为人们营养 所需和日常消费的重要来源。但另一方面，较高的肉类生产成本和价格致使部分不法商贩 以次充好、掺假造假事件及所谓的"挂羊头卖狗肉"时有发生，"假牛肉事件"和"马肉风波" 等食品问题便是典型案例，这不仅损害了消费者的利益，同时带来诸多社会问题。当今的食 品种类更加丰富多样化，一部分加工食品改变了外观和气味；与之同时，网络销售也给掺假 造假带来了可乘之机。
[0003] 早期肉类鉴别主要依赖于感官和形态学检验，这些检验方法受到仪器、人员经验 和样本处理过程等诸多局限性，准确性低，尤其对于深加工的肉类以及饲料中添加的动物 源性成分基本无法鉴别。随着分子生物学的发展，鉴定技术发展了形态学分析和成分鉴定 方法，在这个过程中基本确立了以特征性的蛋白和核酸作为靶标物质进行检验的思路，如 今形成了蛋白检验和DNA分析两个不同的检测方向。经过20多年的发展，两种鉴别技术在 精度和灵敏度均有极大提高。但是当肉类经过物理处理如切碎、混合、腌制、蒸煮和熏烤等 过程后失去了原有形态和质地，蛋白质鉴定技术很难满足对这些样品检测的需要。而DNA 尤其是线粒体DNA(mtDNA)具有耐热性强、不依赖于细胞形态、种间多态性好等特点，表现 出更高的准确度和精度以及重复性，成为近年来物种鉴定"DNA条形码"技术发展的首选靶 标。
[0004] 国家监管部门先后颁布多项法律法规来规范动物性食品加工销售的多个环节，在 技术上也制定了一系列的方法标准用于常见肉类动物成分的检测。但另一方面，大部分现 行国家标准的检测对象为单一物种或同类物种，检测效率低，对于未知物种更是难以鉴定。 同时，多数方法基于荧光定量PCR技术，存在对仪器要求高、试剂相对价格高等特点，对大 批量样品进行筛选的成本高、耗时长，难以在基层检测部门开展推广应用。因此，建立一种 简便易行且可以同时鉴定多种动物源性成分的检测方法以便提高检测工作效率，这对未知 动物源性成分的溯源鉴定也具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有物种鉴定技术中一次只能鉴定一个物种、而多重PCR技术又存在特 异性低的不足，本发明提供了一种能在一次PCR操作中鉴别山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、 骆驼和牦牛8种动物源性成分的方法，及由此获得的物种鉴定检测试剂盒。
[0006] 申请人经过对多种常见物种的mtDNA全序列做精细对比，获得了山羊、绵羊、水 牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8个物种的mtDNA特异性插入-缺失片段，因此可在PCR扩增 后依据扩增产物同时鉴定这些物种，提高了检测效率。
[0007] 本发明的方法，包括如下步骤：
[0008] 1)提取待检测样品的基因组DNA，将提取的样品基因组DNA溶于TE溶液中保存备 用；
[0009] 2)利用PCR引物对检测样品的基因组DNA进行PCR扩增反应；
[0010] 所用引物序列如下：
[0011] 上游引物：CCTCCCTAAGACTCAAGGAA(SEQIDNO:1)、
[0012] 下游引物：AGCGGGTTGCTGGITTCACG(SEQIDNO:2);
[0013] 3)对PCR产物进行电泳检测，依据PCR产物条带大小和有无可判定检测样品中是 否含有上述8种动物源性成分，其中山羊、绵羊、鹿、水牛、家牛、牦牛、猪和骆驼扩增后获得 对应片段大小分别为 760bp、737bp、537bp、486bp、481bp、464bp、429bp和 359bp。
[0014] 作为优选，在步骤2)同时设置阳性和阴性对照组。
[0015] 步骤2)的PCR反应程序如下：
[0016] 95°C变性 5min;95°C变性 30s，退火 61. 5°C35s，72°C延伸 30s为一个循环，共计 30 个循环；然后72°C保持lOmin。结束后降温至4°C。
[0017] 所述的阳性对照为完好的山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛基因组DNA 样品，阴性对照为双蒸水。
[0018] 本发明还提供一种适用山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛成分检测的PCR 试剂盒，其包含下列试剂及合适浓度：
[0019]PCRA液：含有dNTP、MgCl2、PCRbuffer、Taq聚合酶、引物和双蒸水。
[0020] PCRB液：含有阳性DNA模板，包括山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼、牦牛的基 因组DNA。
[0021] 本发明与现有技术相比，可以在一次PCR反应中检测山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、 鹿、骆驼和牦牛8个物种，且具有良好的特异性和灵敏性。相对现有检测技术大大提高了检 测效率，尤其对于未知物种成分的溯源检测具有重要意义。相比更为复杂的多重PCR技术， 本发明在一定程度上提高了灵敏度，更为重要的是一次PCR就可以鉴定8个物种，大大提高 了筛选和检测的效率。本发明基于PCR技术平台开发，对实验室设备要求不高，适于绝大多 数单位应用。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明对山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛的DNA样品的PCR扩增 电泳检测结果。图中所示为泳道编号1-8和对应产物大小（第二行数字是对应PCR产物大 小，单位bp) :1 :山羊；2:绵羊；3 :鹿；4:水牛；5:家牛；6:牦牛；7:猪；8:骆驼。参照分子 量标注依次是 1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp*100bp。
[0023] 图2是本发明对8种动物DNA样品PCR产物SspI酶切鉴定的检测结果。图中各泳 道标注了物种名称，其酶切后对应产物片段大小如下：山羊：291bp、192bp、160bp和118bp; 绵羊：300bp、213bp和 75bp;鹿：391bp和 146bp;水牛：486bp;家牛：303bp和 178bp;耗牛： 214bp、178bp和 73bp;猪：300bp和 129bp;骆驼：359bp。
【具体实施方式】
[0024] 申请人经过对山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8个物种及常见动物（包 括鸡、鸭、鼠、兔、狗、马、驴、鱼类）的mtDNA全序列做精细对比，发现了这些物种的保守序列 以及所辖区间特有的变异序列，这段变异序列在物种间存在插入-缺失多态性，因此可以 用于物种鉴定。在保守区设计引物，经过PCR条件优化后完全能够达到预期效果且扩增片 段大小与预期结果一致，特异性和稳定性良好，更为重要的是可在一步PCR中同时鉴定这8 个物种，提高了物种溯源研宄和检测效率。
[0025] 下面结合实例对本发明的方法过程做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限 于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克 (Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进 行。本领域相关的技术人员可以借助实例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护 和权利要求范围不限于所提供的案例。
[0026] 实施例1引物设计
[0027] 根据GenBank所公布的基因序列，以山羊（⑶229278)、鹿（HQ191428)、水牛 (AF702618)、牛（EU177861)、绵羊（KF938337)、牦牛（KM233416)、猪（AF486867)和骆驼 (AP003423)的mtDNA全序列为模板，通过比对分析8个物种和常见物种（鸡、鸭、兔、鼠、马、 狗）的mtDNA序列，根据其基因序列的特异性和保守性，利用Primerpremier5.0软件，设 计多个物种的通用引物，该引物与上述山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8个物种 的mtDNA序列配对。引物序列如下所示：
[0028] 通用下游引物（SEQIDNO:1) :AGCGGGTTGCTGGITTCACG、
[0029]通用上游引物（SEQIDNO:2)