丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系Padlock探针及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及丁香假单胞菌黄瓜致病变种（Pseudomonas syringaepv.lachrymans)黄瓜株系Padlock探针及应用。本发明提供的探针适用于口岸 检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
【背景技术】
[0002] 黄瓜细菌性角斑病是在黄瓜上由丁香假单胞菌黄瓜致病变种（Pseudomonas syringaepv.lachrymans)引起的的一种常见细菌性病害。主要在黄瓜幼苗和成株上发病， 为害叶片、叶柄、卷须、茎蔓和瓜条。发病初始时产生水渍状小斑点，因受叶脉的限制，后期 病斑呈现多角形，淡黄色至褐色，最后叶会干枯、破裂。黄瓜细菌性角斑病菌在发病叶片背 部溢出乳白色的菌脓，但这种典型症状特点我们在实际田间或者大棚内不太能经常看到。 一般我们能看到色泽不一致的多角形病斑。病菌在植物体内的新陈代谢作用往往受温度所 影响，其最适温度为25°C左右。在适宜发病条件下，黄瓜细菌性角斑病的发病、扩展蔓延的 时间很短，能使整株黄瓜叶片枯死，影响植株结果，造成严重的经济损失。
[0003] 黄瓜细菌性角斑病主要以带菌种子进行远距离传播，种子也可随病残体遗留于土 壤中作为最初侵染源。角斑病菌通过水溅或者其他途径，侵入幼苗子叶、水孔或伤口，引起 寄主发病。黄瓜细菌性角斑病菌除了能侵染黄瓜外，还能侵染萌芦、西萌芦等萌芦科，以及 一些非萌芦科作物。近年来黄瓜细菌性角斑病在中国有逐年加重的趋势，将严重影响黄瓜 产业的发展。因此对黄瓜细菌性角斑病菌的研宄具有重要的经济价值。
[0004] 国内第一例黄瓜细菌性角斑病由俞大绂等报道，黄瓜细菌性角斑病在国内的 传播蔓延和为害情况从八十年代末开始开始受到关注。黄仲生等于北京、内蒙和辽宁 三地的黄瓜上分离到大量菌株，经过鉴定均为丁香假单胞菌黄瓜致病变种（P.syringae pv.lachrymans)，同时对其发病症状同样进行了描述。1991年金潜等人通过一系列的实验 证明黄瓜细菌性角斑病和甜瓜细菌性角斑病均是丁香假单胞菌黄瓜致病变种引起的（金 潜等，1991)。1988年孙福等人在黄瓜病株上分离得到该病原菌并通过人工接种的方法研宄 了其寄主范围，其黄瓜病株来源于辽宁省、内蒙古和北京市等地（孙福在等，1988)。2000， 年张昕等人在新疆哈密瓜上分离到11个菌株，通过一系列鉴定方法发现有9株为丁香假单 胞菌黄瓜致病变种（张昕等，2001)。2004-2005年，李亚利等在甘肃省瓜类植株上采集到叶 片和果实，该叶片和果实具有类似于西瓜果斑病的症状，通过分子生物学方法鉴定病原菌 为黄瓜细菌性角斑病菌，并证明了黄瓜细菌性角斑病菌还可以侵染辣椒、番茄等茄科植物 (李亚利等，2006)
[0005] Padlock探针是一条长的寡聚核苷酸链，长度为100bp左右，探针两端（磷酸化的 5端和羟基化的3端）能与目的片段进行特异性的结合。探针两端称为T1端和T2端，探针 两端有很强的特异性，只有与目标片段完全匹配时，其在连接酶的作用下，探针两端与靶标 片段互补形成环状。为了使这项技术用于病原菌的诊断，Marianna Szemes等人对如何保 证高特异性和在实际检测中没有目的靶标的情况下如何消除自身连接反应进行了优化。将 T1端和T2端设计成不对称的两端，并且T2端（3'端）明显短于T1端（5'端）（Marianna Szemes等 2005)。
[0006]Padlock探针除了T1端和T2端外，还包括一段特异性序列和通用序列，特异性序 列我们称为zipcode，通用序列称为P1端和P2端。将目标检测物提取DNA后，将待检测的 DNA与设计好的探针进行连接，在连接酶的作用下探针T1端和T2端与靶标DNA完全序列互 补时，探针T1端和T2端在靶DNA上相邻连接形成稳定的环状（LarssonC，2004)。探针不 能与DNA完全匹配时则以线状存在。然后用核酸外切酶I和核酸外切III对错配和没有成环 状的探针进行消化去除，消化后用通用引物对消化后的产物进行普通PCR扩增。产物进行 凝胶电泳通过电泳条带的有无能初步判定检测结果。为进一步确定实验的可靠性，将扩增 后的产物进行杂交。先将zipcode的反向互补序列用地高辛标记，产物固定于尼龙膜上，然 后将标记好的zipcode的反向互补序列与尼龙膜上的产物进行杂交，通过膜上的杂交信号 能更好的判定目标检测物中是否存在特定的病原检测物。
[0007]MariannaSzemes等，运用Padlock探针结合Microarray技术对十种重要的植物 病原菌进行了检测并对这种技术成功的进行了优化，结果表明这是一种灵敏度跟特异性很 好，效率很高的高通量检测技术。
[0008] 田艳丽（2008)对6种重要植物病原菌进行了高通量检测，其中包括四种我国对外 检疫病原菌。并且成功的将其运用于实际样品检测，其中在瓜类细菌性果斑病菌上设计的 Padlock探针能将其成功与燕麦褐条病菌区分开，并且这两种病原菌所选的特异性序列只 有一个碱基的差异。这是其它分子检测手段很难达到的（田艳丽，2008)。
[0009] 王辉等Padlock探针技术用于5种支原体的检测，将ITS间隔区作为靶标区域。并 同时进行了 5种支原体的高通量检测。结果表明多重检测结果与单一的探针检测结果相一 致。有高敏感性和特异性（王辉等2010)。
[0010]目前主要用普通PCR对丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系进行检测，而普通 PCR容易出现假阳性等问题，发明Padlock探针的目的在于避免常规的PCR等检测方法易受 检测样品中杂质干扰、以及假阳性的现象。
[0011] Padlock探针有很强的特异性，能够检测单碱基突变，弥补了普通PCR的不足。设 计探针的前期是找到一条特异性的序列，得到特异性序列后并不能简单的得到一条特异性 探针。特异性探针的设计是一个大量筛选和反复验证的过程。Padlock探针是一条长的寡 聚核苷酸链，长度为l〇〇bp左右，探针两端（磷酸化的5端和羟基化的3端）能与目的片段 进行特异性的结合。探针两端称为T1端和T2端，探针两端需要有很强的特异性，所以T1 端和T2端的位置、长度、GC含量等都要经过反复考量，无数次的试验后最后才有可能得到 一条特异性强和灵敏度高的探针。
[0012] Padlock探针具有很强的特异性，只有与目标片段完全匹配时它才能形成环状， Padlock探针能够检测单碱基突变，探针不能与DNA完全匹配时则以线状存在。然后用 Exonuclease I和Exonuclease III错配和没有成环状的探针进行消化去除，消化后用通用 引物对消化后的产物进行普通PCR扩增。将Padlock探针结合Microarray技术能够实现 丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系高通量检测。此方法避免了常规的PCR等检测方法易 受检测样品中杂质干扰、以及假阳性的现象。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的在于提供了一种丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探 针，探针序列为SEQIDNO. 1所示。利用本发明提供探针，可避免常规的PCR等检测方法易 受检测样品中杂质干扰、以及假阳性的现象。可对丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系进 行检测，并且特异性强、灵敏度高。
[0014] 本发明的另一个目的在于提供丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探 针的应用，包括利用该探针制备丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系检测试剂盒，或将其与 Macroaary结合进行高通量检测。
[0015] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0016] 本发明的发明思路为：将丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系与其他细菌的序列用 软件进行序列比对，选取核苷酸特异部分为Padlock探针为T2端，靠近T2端的作为T1端。 然后与GenBank登录的所有细菌序列比较以确保待检测细菌Padlock探针的特异性。特异 性探针的设计是一个大量筛选和反复验证的过程，T1端和T2端为不对称的两端，并且T2端 (3端）明显短于T1端（5端），T1端和T2端的位置、长度、GC含量等都要经过反复考量，试 验。探针的总长度为l〇〇bp左右，所以T1端和T2端的长度和位置都是可变的，设计过程中 先确定一个位点，分别从两边设计T1端和T2端，若先确定T1端后，T2端从10-25个碱基数 依次试验特异性，若先确定T2端的数量，则依次找寻最佳T1端位置和数量，直到找到最佳 位点设计特异的T1端和T2端。本发明寻找了许多看家基因，分别在不同看家基因的的