氘化核糖核苷、n-保护的亚磷酰胺以及寡核苷酸的合成的制作方法
【专利说明】氘化核糖核苷、N-保护的亚磷酰胺以及寡核苷酸的合成 发明领域
[0001] 本发明涉及寡核苷酸以及寡核苷酸合成，并且更具体来说，涉及修饰的RNA、亚磷 酰胺和RNA寡核苷酸，以及用于合成RNA的方法，所述RNA含有供合成修饰的寡核苷酸用的 部分或完全饱和的氘化糖和/或核碱基以及氘化亚磷酰胺。
[0002] 发明背景
[0003] 本发明涉及以下的合成：能够展现出生物化学上有用且生物学上有价值的特性、 因此具有潜在治疗用途的高纯度氘化糖、氘化核碱基、氘化核苷，以及限定序列的氘化RNA。 过去数十年中，已经开发出许多RNA和DNA序列，其用于治疗剂、诊断剂、药物设计、细胞内 环境中RNA序列的选择性抑制，以及阻断细胞内存在的不同类型的RNA的功能。一种方法 是使用反义技术。反义寡核苷酸可用于在哺乳动物细胞中特异性地抑制不当基因表达。反 义寡核苷酸可用于杂交并且通过活化RNA酶H而抑制RNA、典型地信使RNA的功能。首先， 寡核苷酸通过活化RNA酶H影响靶RNA的水平，所述RNA酶H裂解DNA/RNA杂合体的RNA 链。因此，已提议反义寡核苷酸用于治疗疾病。尽管所述技术有潜力成为用于所有疾病的 强大工具，但包括分子稳定性在内的数个问题阻碍了所述技术成为主要疾病对抗疗法。
[0004] 另一方法聚焦于使用基于核酸的分子使基因表达在mRNA水平沉默。RNA干扰 (RNAi)提供选择性基因抑制的更大潜力，并且提供控制和管理各种生物化学以及药理学 过程的更大希望。早期研宄说明秀丽隐杆线虫（C.elegans)中的RNA干扰是由21和22 个核苷酸的RNA介导，参见Fire等，Nature，391，806-811，1998。这由说明以下的研宄 进一步证实：通过小的双链RNA特异性抑制基因表达的一般现象是由21和22个核苷酸 的RNA介导（Genes Dev.，15，188-200,2001)。同时进行的研宄证实通过小的双链（dS) RNA对特异性基因表达所致的所述现象在无脊椎动物和脊椎动物中是相似的。各种研 宄已说明RNAi可用作选择性和特异性基因抑制和调控的强大工具，参见Nishikura，K.， Cell，107,415-418, 2001 ;Nykanen 等，Cell，107,309-321，2001 ;Tuschl，T.，Nat. Biotechnol.，20, 446-448, 2002 ;Mittal，V.，Nature Rev.，5, 355-365, 2004 ;Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6047-6052, 2002 ；Donze, 0. &Picard, D. , Nucl. Acids. Res.，30, e46, 2002 ;Sui，G 等，Natl. Acad. Sci. USA，99,5515-5520, 2002 ;Paddison，等， Genes Dev. ，16,948_959,2002。
[0005] 除了使用天然双链（ds)RNA序列，化学修饰的RNA已示出在用于siRNA活性的序 列中使用2' -脱氧-2' -氟-D-阿糖核酸（FANA)而在哺乳动物细胞中引起类似的或增 高的 RNA 干扰，参见 Dowler 等，Nucl. Acids Res.，34,1669-1675, 2006。已寻求改进 SiRNA 特性的各种其他修饰，包括改变骨架化学、2'-糖修饰、核碱基修饰，参见Nawrot，B等，Med. Chem.，6, 913-925, 2006 以及 Manoharan，M.Curr.Opin.Chem. Biol.，8, 570-579, 2004 的综 述。尽管已容许SiRNA的修饰，但数个研宄指示毒性增大且功效降低，参见Harborth，等， Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，13,83_105,2003。Chiu 等证明尽管 2'-〇-甲基修 饰维持A形式的RNA样螺旋，但确实保留了 SiRNA活性，或在一些情况下，降低了 SiRNA活 性，这取决于序列内所述修饰的数量，参见RNA，9,1034-1048, 2003。还已示出可在有义链中 对序列进行广泛2' -0甲基修饰，而不损失SiRNA活性，参见Kraynack, B. A.，Baker, B. F.， RNA，12,163-176,2006。已将赋予高结合亲和力的双环锁定核酸（LNA)引入SiRNA序列，尤 其是在避免SiRNA序列的中心区的情况下，参见Braash等，Biochemistry，42,7967_7995， 2003。类似地，已示出含有刚性构象的阿卓糖醇糖修饰的寡核苷酸（ANA)以一种序列特异 性方式与RNA形成可降解的双链体。另外，ANA已示出保留A (RNA类型）构象。Fisher, M. 等，Nucl. Acids Res.，35,1064-1074,2007证明与未修饰的对照相比，靶向MDR1基因的ANA 修饰的siRNA展现出改善的功效、在修饰接近有义或反义链的3'端时尤其有效。
[0006] 数个研宄已指示SiRNA通过各种递送系统吸收的潜力。所述递送系统然后可在治 疗剂的开发中利用。胆固醇缀合的siRNA可实现递送到细胞中并且使基因表达沉默。另 外，脂质缀合的siRNA、胆汁酸以及长链脂肪酸可介导siRNA吸收到细胞中并且体内使基因 表达沉默。siRNA缀合物在组织中的有效且选择性吸收取决于与脂蛋白颗粒的最大缔合性、 脂蛋白/受体相互作用以及跨膜蛋白介导的吸收。高密度脂蛋白将siRNA的递送导向到肝 脏、肠管、肾脏以及含有留类的器官中。此外，LDL将siRNA主要导向到肝脏中。研宄指示 LDL受体涉及在siRNA的递送中。因此，已提议siRNA可经设计具有化学修饰以便保护免 于核酸酶降解、消除炎症、降低脱靶基因沉默，并且从而提高对靶基因的有效性。脂质和允 许增高的细胞吸收的其他亲脂性分子的递送媒介物或缀合物对于治疗开发是必需的。所述 siRNA目前正开发用于人类靶标验证，并干扰疾病途径且开发新的领域用于药物开发。
[0007] siRNA的有义链的3'端可被修饰，并且在此端附接配体是最合适的，参见例如 Ya-Lin Chiu 和 Tariq Rana，RNA，9,1034-1048,2003 ;M.Manoharan，Curr.0pin.Chem. Biol，6, 570-579, 2004 ;Nawrot，B?和 Sipa，K.，Curr. Top. Med. Chem.，6,913-925,2006; Scaringe，S?等，Biotechnol.，22, 326-30, 2004。亲脂性或疏水性基团的引入和siRNA递送 的增高以及靶标的最优化已通过生物缀合解决并实现。通常，附接在有义链的3'端进行， 但可在反义链的3'端进行。核酸酶抗性siRNA的设计曾为尝试开发有效治疗剂的深入研 宄和开发的主题。因此，碱基修饰如2-硫代尿苷、假尿苷以及二氢尿苷已说明了对RNA分 子的构象和相关联的生物活性的作用，参见Sipa等，RNA，13,1301-1316, 2007。Layzer等， RNA，10, 766-771，2004说明2' -修饰的RNA、尤其是2' -氟对核酸酶具有极大的抗性并且 体内具有生物活性。Dande等，Med. Chem.，49,1624-1634,2006使用4'-硫代修饰的糖核苷 组合2'-〇烷基修饰来改进siRNA特性和RNAi增大。Li等，Biochem. Biophys. Res. Comm.， 329,1026-1030, 2005 和 Hall 等，Nucl. Acids Res.，32, 5991-6000, 2004 说明用 siRNA 的硫 代磷酸酯和硼烷磷酸酯体内置换核苷酸间磷酸酯。
[0008]除了核苷的体内稳定性和适当修饰，siRNA分子、RNA分子、适体以及合成DNA分 子的生物缀合要求细胞膜渗透性的关键特征。不充分的跨膜细胞吸收限制siRNA、其他单 链RNA或甚至各种DNA分子的实用性。因此，已经示出附接在siRNA的3'端的胆固醇改善 体内细胞运输和基因的治疗性沉默，参见Soutschek等，Nature，432,173-0178, 2004。除 了胆固醇，已开发了各种缀合，包括天然和合成蛋白转导结构域（PTD)，还称为细胞渗透肽 (CPP)或膜永久肽（MPP)。PTD为能够与质膜相互作用的短的氨基酸序列。MPP-siRNA缀 合物的吸收迅速发生。所述肽可优选地缀合至链的3'端。PEG(聚乙二醇-寡核苷酸）缀 合物已用于各种缀合复合物，并且在靶细胞中吸收后具有显著的基因沉默作用，参见Oishi 等，.Am. Chem. Soc.，127,1624-1625, 2005。适体已用于siRNA的位点特异性递送。考虑到 适体对其靶标具有高亲和力，siRNA的缀合物充当优良的递送系统并且使得有效抑制靶基 因表达，参见Chu等，Nucl. Acids Res.，34(10)，e73, 2006。这些分子可缀合在siRNA或其 他生物活性寡核苷酸的3'端。在3'端的各种脂质缀合可附接至通过本发明描述的方法合 成的寡核苷酸并且可用于寡核苷酸的有效内化。亲脂性部分由羟基官能组成，以合成亚磷 酰胺。类似地，亲脂性部分可在末端处具有羧酸官能。后者可偶联至具有间隔子的3'-氨 基，这通过使用DCC(二环己基碳二亚胺）或类似的偶联剂最后添加反向合成的寡核苷酸 的氨基连接体如C-6氨基连接体亚酰胺至羧酸部分合成，参见Paula等，RNA，13,431-456， 2007〇
[0009] 微小RNA(miRNA)为一大类非编码RNA，其已示出在基因调控中起作用，参见 Bartel，D.P. Cell，116,281_297 ;He 等 Nat. Rev. Genet，5:522_531，2004;Lagos-Quintana 等，Science，204:853-858, 2001。据估计在整个人基因组中散布有至少1000种miRNA。许多 这些miRNA已示出下调大量靶mRNA，参见Lim等，Nature，433:769-773，2005。miRNA的不同 组合可涉及在哺乳动物细胞中靶基因的调控中。siRNA已经示出充当miRNA，参见Krek等， Nat. Genet.，37:495-500, 2005 ;Doench 等，Genes Dev.，17:438-442, 2003。微小 RNA 具有极 大潜力在基因调控中作为治疗剂，Hammond, S.M.，Trends Mol. Med. 12:99-101，2006。当前 大量努力正致力于了解miRNA途径、其在发育和疾病中的作用以及其在癌症中的作用。另 外，正开发miRNA靶标用于治疗和诊断开发。鉴别出大量miRNA，并且通过微测定、PCR和信 息学确定其作用。设计来祀向miRNA的RNA的合成还要求RNA合成和类似的修饰，如对于 SiRNA所要求的，以稳定RNA和生物缀合，从而产生较好的细胞吸收。本发明将极大地加速 这一研宄和开发的步伐。
[0010] 治疗等级的RNA、反义RNA或siRNA的合成要求寡核苷酸的3'端的修饰或标记。 在siRNA情况下，通常为有义链的3'端。使用3'至5'合成法，要求亲脂性、长链配体或发 色团的3'端修饰的RNA的合成具有挑战性，并且要求对应的固体载体。所述合成通常导致 低的偶联效率和总体上较低的最终寡核苷酸纯度，这是因为大量截短序列含有所需的疏水 性修饰。本发明的作者通过开发反向RNA单体亚磷酰胺用于在5'至3'方向上进行RNA合 成解决了这一问题。这一方法产生极清洁的寡核苷酸合成，因此允许在3'端清洁且有效地 引入各种修饰。
[0011] 为增大稳定性，已合成含有脂质的寡核苷酸。附接脂质提供RNA的有效递送 和寡核苷酸的细胞浓度的增大。疏水性分子如胆固醇可结合LDL颗粒和脂蛋白以便活 化涉及这些蛋白质的递送过程，从而运送寡核苷酸。脂质化的核酸还可降低寡核苷酸 的亲水性。还示出脂质性核酸改善寡核苷酸的功效，参见Shea等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,6553,1989 ;0berhauser，B?和 Wagner，E.，Nucleic Acids Res.，20,533， 1992 ;Saison，_Behmoaras 等.The EMBOJournal，10,1111，1991 ;Reed 等，Bioconjugate Chem.，2,217，1991 ;Polushin 等，Nucleosides&Nucleotides，12,853，1993 ;Marasco 等， Tetrahedron Lett.，35, 3029,1994。将一系列疏水性基团如金刚烧、二十碳稀酸、胆固醇以 及二（十六烷基）二醇在3'端附接至寡脱氧核苷酸序列并且杂交至互补的RNA序列。发现 Tm未受影响，这指示所述基团不干扰寡杂交特性，参见Manoharan等，Tetrahedron Lett.， 36,1995 ;Manoharan 等，Tetrahedron Lett.，36, 3651-3654,1995 ;Gerlt，J. A. Nucleases， 第二版，Linn, S. M.，Lloyd, R. S.，Roberts, R. J.，编? Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 10 页，1993。
[0012] 为有效递送合成的RNA分子，PEG附接至各种寡核苷酸已示出有利特性。PEG-寡 聚物已通过防止快速消化而示出酶促稳定性。热熔融行为不受影响，从而保留双链结构 (formation)的特性。Srivastava 等，Nucleic Acids SymposiumSeries，2008, 52,103-104 最近开发了一种反向RNA合成方法，用于将亲脂性且大的分子清洁不接至合成的RNA。
[0013] 现有技术说明
[0014] 已针对许多核苷和寡核苷酸进行氘标记研宄与NMR分析。DNA和RNA的结构和动 力学对于了解其生物学功能是重要的。这通过多种物理化学技术来调研。在这些技术中， 核磁共振（NMR)光谱法已广泛用作强大工具，因为其提供暗示局部结构变异的构象信息和 一定生物学条件下的动力学。这已使用强大计算机和高共振能仪器而改进。随着磁场增 大，较高灵敏度降低获得优质光谱所需的寡聚物的量，并且增大共振信号的分散，从而降低 由于第二级J耦合至第一级引起的共振重叠所致的光谱复杂性。进行描述将氘并入脱氧 核苷、核糖核苷以及修饰的核苷的特定位置的大多数研宄，以尝试通过质子核磁共振（NMR) 确定寡核苷的结构以及构象细节。寡核苷酸的质子NMR光谱通常相当复杂并且不揭示出构 象与结构信息。由于寡核苷酸具有显著重叠NMR共振，氣化寡核苷酸的结构确定已用于生 物功能性DNA或RNA分子的NMR结构确定。为克服与共振相关的问题，研宄人员开发了非均 一氣标记技术，参见 Foldesi 等，J. Tetrahedron，1992,48,9033 ;Foldesi 等，J.，Biochem. Biophys. Methods，1993, 26。氣标记的寡核苷酸简化了 NMR光谱，从而允许按明确的方式从 大分子的小结构域确定J親合与N0E体积，参见Glemarec等，J. Nucleic Acids Res.，1996， 24,2002 和 Ludwig，J. Acta Biochem.Biophys Acad Sci.，1981，16,131〇
[0015] 类似地，大量寡DNA和RNA的位点特异性氘化已用于通过"NMR窗口"概念研宄NMR 结构，在所述窗口中仅寡核苷酸的小节段是NMR可见的。使用这种方法来解决以下各物的 NMR结构：21 聚体RNA发卡环，参见Nucleic Acids Researchl996 24:1187和Nucleosides and Nucleotides 1997, 5&6, 743 ;和31聚体茎-内环-茎-内环-茎-发卡环RNA。非对 映特异性C-2'（寡DNA中氣标记的核苷区段（Journal Tetrahedron，1995,51，10065))成 功用在NMR解释，降低的自旋扩散收集以及吨1'、H2"以及吨1'、H2"耦合常数的提取中。
[0016] Huang 等，Acids Research，1997,25,4758-4763 示出在寡核苷酸的二维（2D) N0ESY光谱中，如果嘌呤的H-8和嘧啶的H-6被氘置换，那么使核碱基与糖质子相关联的整 个交叉峰消失。类似地，研宄人员关注通过2H NMR研宄蛋白质与DNA相互作用动力学的作 用。固态2DNMR提供关于寡核苷酸中各种官能团的移动的有价值信息。Chirukul和其共 同工作者示出特异性氣化在确定所述结构特征中起着极其重要的作用，参见Nucleosides， Nucleotides and Nucleic acids，2001，20,1903-1913。
[0017] 代替氢，用氘取代的酶识别或酶促结合未受到不利影响。特定序列的酶识别是寡 核苷酸关于其特异性作用的生物化学相互作用的第一步，并且氘标记不会改变位点识别的 生物化学过程。类似地，已知双链的杂交不受氘标记影响，这是由于氘和氢原子半径对于识 别模式的任何破坏都是极其接近的。
[0018] 预期代替氢氘在寡核苷酸的糖部分中的多个共价标记（碳-氢键成为碳-氘键） 减缓寡核苷酸的消化速率，寡核苷酸的消化在细胞环境中用外切酶和内切酶快速发生。寡 核苷酸的快速消化由寡核苷酸的较短半衰期和从身体的清除得以证明。与DNA分子相比， 这在RNA分子方面是更为显著的。预期治疗性寡核苷酸的缓慢消化为治疗候选物增添了额 外的优点，而同时其他物理或化学特性不受影响。期望氘化核糖寡核苷酸的各种生物化学 作用，预期氘化寡聚物减缓寡核苷酸消化成较小的片段，并且不具有关于氢键合、RNA酶H 校正活性或通过RISC复合物识别的作用。细胞内水解或氘交换可导致氧化氘（D 20)的释 出。
[0019] 已常规地进行氘交换的酶促法用于氘标记。然而，交换法不完全，这是由于酶促反 应中存在平衡。期望氘标记的寡核苷酸将在细胞环境中用氢类似地交换氘，从而导致氧化 氘在细胞环境中释放。由于氧化氘已知为一种营养剂，因此本发明的寡核苷酸可提供营养 价值。
[0020] 已相当广泛地进行使用氘交换用于核苷和寡核苷酸的光谱分配。核碱基残基的氘 化已描述在质子在C8-嘌呤和C5-胞嘧啶处用氘代亚硫酸氢铵在pH 7. 8下在脱氧寡聚物 中进行交换中，所述交换导致90-95原子％的屯并入。Brush等，Biochemistry 1988, 27， 115出1~11811等.4111.〇16111.5〇(3.1998，110,4405 描述了在胸苷的05-甲基处在21120中进行的 铂催化的交换。
[0021] 已经开发了多种多样的酶促和化学方法来用于在糖与核苷水平二者上并入氘，从 而提供高水平的氘并入0VH比）。氘交换的酶促法通过具有低并入水平并且提供显著水 平的杂散共振。酶促并入具有另外的复杂性，这是由于分离氘化单核苷酸区段所要求的繁 琐的分离技术。Schmidt 等，Ann. Chem. 1974,1856 ;Schmidt 等，Chem. Ber.，1968, 101，590 描述了 5'，5 "-2H2-腺苷的合成，其是由2'，3' -0-异亚丙基腺苷-5' -甲酸或甲基-2, 3-异 亚丙基 _0_D_ 核糖呋喃酸糖酸（furanosiduronic acid)制备，Dupre，M?和 Gaudemer，A.， Tetrahedron Lett. 1978, 2783。Kintanar 等，Am. Chem. Soc. 1998,110,6367 报道了可使用 硼氘化钠或氘化铝锂（98原子％的2H并入），通过还原适当的5' -醛，获得5' -氘代腺苷与 5'（R/S)-氣化胸苷的非对映异构体混合物。Berger等，Nucleoside&Nucleotides 1987,6， 395描述了通过在2H20/吡啶混合物（1:1)中加热醛、接着用NaBD 4还原醛将2'脱氧鸟苷的 5' -醛衍生物转化成5'或4' -氘代-2' -脱氧鸟苷。
[0022] Ajmera 等，Labelled Compel. 1986, 23,963 描述了获得 4'-氣标记的尿苷和胸苷 (98 原子％的211)的程序。Sinhababu 等，J. Am. Chem. Soc. 1985，107,7628)证明了在糖合成 过程中，在使用硼氘化钠立体选择性还原1，2:5, 6-二-0-异亚丙基-B-D-己呋喃糖-3-酮 水合物成为1，2:5, 6-二-0-异亚丙基-3-氘代-B-D-己呋喃核糖并且随后进一步进行核 苷合成时，氘并入在腺苷的C3'（97原子％ 2H)处。Robins等，Org. Chem. 1990, 55,410报 道了在通过硼氘化钠在乙酸中还原2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基（TBDMS)3-酮核苷时， 以实际