动物饲料酶提取的制作方法
【专利说明】动物饲料酶提取 发明领域
[0001] 本文公开的实施方式涉及用于量化饲料和营养颗粒中酶活性的组合物和方法。
[0002] 发明背景
[0003] 生物可利用的载体产品一一例如动物饲料颗粒、植物肥料颗粒、或用于害虫控制 的颗粒产品一一通常利用一种或多种酶强化以增加其成分的生物利用率。这种强化可以对 颗粒的效用具有影响，增加颗粒的有效性，减少满足消费者需要所需的颗粒产品的量，并且 减少源于颗粒使用的废物。
[0004] 为了生产具有一致性能的产品，重要的是，每一批次中酶活性的量是精确地可测 量的。然而，制粒过程通常涉及高达70°C、75°C、80°C、85°C、88°C、90°C、93°C、95°C或更高 温度的热处理。通常使用较高的温度，因为它们可以减少处理时间，生产不太可能破碎的颗 粒，并且最终降低产品成本。
[0005] 然而，这些热处理可以在许多方面使酶活性的量化复杂化。例如，热处理可以钝化 颗粒中的酶，或者使其在不破坏它们的活性的情况下实质上更难以提取，或者二者。结果， 生产具有一致的、已知酶活性的颗粒产品是一个重大挑战。
[0006] 肌醇六磷酸酶是可以具有在动物饲料颗粒中作为补充物的功效的酶的实例。肌 醇六磷酸酶降解肌醇六磷酸为肌醇核和一个或多个游离的磷酸盐分子。肌醇六磷酸由肌 醇核组成，所述肌醇核共价链接至六个磷酸盐基团。肌醇六磷酸是植物材料例如大豆种子 的成分，其用于产生用于动物的饲料颗粒，所述动物例如非反刍动物例如家禽、肉鸡、鸟、小 鸡、产蛋鸡、火鸡、鸭、鹅和飞禽；反刍动物例如母牛、家畜、马和羊；家猪（pig)、猪（swine)、 小猪、生长猪和母猪；宠物包括但不限于：猫、狗、啮齿动物和兔子；鱼包括但不限于大马哈 鱼、鲑鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类动物包括但不限于河虾和明虾。因为这些动物不 能够完全消化肌醇六磷酸，所以肌醇六磷酸具有许多有害的影响。它螯合二价阳离子例如 钙和镁，并且它的磷酸盐对于被饲养的动物是生物学上不可利用的形式，导致需要用这些 营养物补充动物饮食，尽管它们在原料中是丰富的。而且，因为这些营养物穿过动物而未经 消化，所以对于能够降解肌醇六磷酸的食物链进一步向下的分解者它们是可以利用的，导 致，例如，与动物流出物接触的地表水中的藻类水华。
[0007] 例如，已经显示出，将肌醇六磷酸酶添加到玉米-大豆饮食可改善育肥猪（Kerr等 (2012) "Effect of phytase on apparent total tract digestibility of phosphorous in corn-soybean meal diets fed to finishing pigs''，J. Animal Sci. 88:238-247)、幼 鸡（Pirgozliev(2011)''The effects of supplementary bacterial phytase on dietary energy and total tract amino acid digestibility when fed to young chickens''， Br.Poult. Sci. 52(2) :245_54)和肉鸡（Powell(2011)"Phytase supplementation improved growth performance and bone characteristics in broilers fed varying levels of dietary calciumPoult Sci. 90 (3) : 604-8 ；ffoyengo (2011) ^Growth performance and nutrient utilization of broiler chickens fed diets supplemented with phytase alone or in combination with citric acid and multicarbohydrase''，Poult Sci. 89(10) :2221-9)中磷酸盐的表观总消化率。
[0008] 目前，用于测量动物饲料中肌醇六磷酸酶活性的标准是通过使用分析社区协会 (A0AC)方法编号2000. 12。当饲料经受动物饲料颗粒化过程中使用的高温时，这种方法对 于测量从动物饲料提取的肌醇六磷酸酶活性产生不一致的结果。这种的方法的问题是当从 动物饲料提取肌醇六磷酸酶时，肌醇六磷酸酶的活性水平可低于实际存在于动物饲料中的 肌醇六磷酸酶量的水平。换句话说，当饲料在高温下制备时，用于提取肌醇六磷酸酶的目前 的方法不能够从动物饲料提取100%的肌醇六磷酸酶活性。
[0009] 然而，改进动物饲料中肌醇六磷酸酶活性的测量已经是长期以来的挑战。Kim等， (2005) "An improved method for a rapid determination of phytase activity in animal feed"J.Anim. Sci. 2005, 83:1062-1067,开发了用于在使用基于A0AC的方法的测量 中降低磷酸盐背景的改进方法。Basu等（U. S. 7, 629, 139B2)使用基于硼酸钠的缓冲液能够 在70 °C、83 °C和86 °C热处理的颗粒中分离68%、23 %和13 %的初始肌醇六磷酸酶活性。
[0010] 而且，添加酶例如肌醇六磷酸酶至动物饲料的要素（component)是本领域技术 人员需要知道在动物饲料中存在多少肌醇六磷酸酶活性。如果用于从动物饲料中提取肌 醇六磷酸酶的目前的A0AC方法是从在75摄氏度下处理的饲料颗粒中仅提取大约60%至 70%的肌醇六磷酸酶以及在86摄氏度下少于15%的肌醇六磷酸酶，那么难以测量肌醇六 磷酸酶活性的总量，这是因为仅测量了总的活性肌醇六磷酸酶的部分。如由使用A0AC方法 的研宄者所指出的，"由分析方法提供的结果表示为活性U/kg并且不基于质量（mg/kg) "， Grizzi 等(2008) "Determination of Phytase Activity in feed ；Interlaboratory Study"Journal of A0AC International 91(2) :259，在 261〇
[0011] 因此，存在提供从高温下产生的动物饲料颗粒的动物饲料中提取多于70%的肌醇 六磷酸酶的方法的需要。
[0012] 更一般地，存在对于开发精确量化热处理的颗粒产品中的酶活性的方法和组合物 的未满足的需要。
【发明内容】
[0013] 本文公开的一些实施方式包含用于从被热处理的固体提取多肽的水性组合物，其 包含胆汁盐洗涤剂、变性剂、碱和水。
[0014] 在一些方面，变性剂是离液剂。在一些方面，变性剂选自脲、胍盐和高氯酸盐。在一 些方面，变性剂是脲。在一些方面，脲以从大约0. 0M至大约3. 0M的浓度存在于组合物中。 在一些方面，脲以大约1M的浓度存在于组合物中。
[0015] 在一些方面，碱是碳酸氢盐。在一些方面，碳酸氢钠以大约50mM至大约200mM的 浓度存在。在一些方面，碳酸氢钠以大约l〇〇mM的浓度存在。
[0016] 在一些方面，水性组合物具有碱性的pH。在一些方面，水性组合物具有大约8. 0至 大约11. 0的pH。在一些方面，水性组合物具有大约8. 5至大约10. 5的pH。在一些方面， 水性组合物具有大约10的pH。在一些方面，水性组合物具有10的pH。
[0017] 在一些方面，胆汁盐洗涤剂包含选自牛磺胆酸、甘氨胆酸、胆酸、脱氧胆酸、石胆 酸、鹅脱氧胆酸和其任意组合的类固醇酸。在一些方面，胆汁盐洗涤剂包含钠阳离子。在 一些方面，胆汁盐洗涤剂是脱氧胆酸钠。在一些方面，脱氧胆酸钠以从大约0. 25%至大约 3.0%的浓度存在。在一些方面，脱氧胆酸钠以1%的浓度存在。
[0018] 一些实施方式包含含有pH10. 0的lOOmM碳酸氢钠、1.0%脱氧胆酸钠和1M脲的 水性组合物。
[0019] 一些实施方式包括从热处理的饲料颗粒提取多肽的方法，其包括以下步骤：提供 包含多肽的热处理的饲料颗粒，其中颗粒已经被热处理至至少70°c，使热处理的饲料颗粒 与水性溶液接触，搅拌与水性溶液接触的热处理的饲料颗粒，和从热处理的饲料颗粒分离 多肽到含水溶液中。在一些方面，方法进一步包含在具有大约或大于临界胶束浓度水平的 洗涤剂的水性溶液中创建环境，并且将热处理的饲料颗粒与温和的变性剂接触，其中温和 变性剂破坏分子间疏水蛋白质-蛋白质相互作用。在一些方面，方法进一步包含提供包含 大约或大于临界胶束浓度水平的洗涤剂的水性溶液。在一些实施方式中，方法进一步包含 提供温和变性剂，其中所述温和变性剂破坏分子间疏水蛋白质-蛋白质相互作用。
[0020] 在一些方面，搅拌包括包含热处理的固体与水性溶液并且涡旋（vortex)所包含 的热处理的固体和水性溶液。在一些方面，方法包含培养温育与水性溶液接触的热处理的 固体。
[0021] 在一些方面，方法包含温育和温和搅拌。在一些方面，温育包含大约20°C至40°C 的温度，或者达到多肽的熔化温度。在一些方面，温育包含大约20°C至40°C的温度，或者达 到多肽的变性温度。
[0022] 在一些方面，多肽是酶。在一些方面，酶在经受该方法后保持催化活性。
[0023] 在一些方面，在接触之前，热处理的固体经受至少75°C的热处理。在另一个方面， 热处理的固体是动物饲料组合物。在另一个方面，动物饲料组合物是来自已经经受了热处 理步骤的固体和