抗体进化免疫原的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求2012年9月12日提交的美国临时专利申请61/700252、2012年10月 1日提交的美国临时专利申请61/708466和2013年2月13日提交的美国临时专利申请 61/764421的优先权，上述每一项申请的全部内容通过引用结合入本文中。
[0002] 本发明在美国国立卫生研宄院授予的资助AI1067854和AI100645的政府支持下 进行。美国政府对本发明拥有某些权利。
技术领域
[0003] 本发明主要涉及HIV-1，尤其涉及广泛中和HIV-1抗体，和HIV-1免疫原，以及在主 体（例如人）中使用该免疫原来诱导广泛中和HIV-1抗体的产生的方法。
【背景技术】
[0004] HIV-1包膜（Env)广泛中和抗体（BnAbs)的诱导是HIV-1疫苗研发的关 键目标。BnAbs可以靶向保守区域，该保守区域包括构象多糖、gp41近膜区、VI/ V2区域、gpl20上结合多糖的C3/V3,和CD4结合位点（CD4bs) (Walker et al， Science 326:285-289 (2009), Walker et al, Nature 477:466-470 (2011), Burton et al, Science 337:183-186 (2012), Kwong and Mascola, Immunity 37:412-425(2012), ffu et al, Science 329:856-861 (2010), ffu et al, Science 333:1593-1602(2011), Zhou et al， Science 329:811-817(2010)， Sattentau and McMichael， F1000 Biol. Rep. 2:60 (2010), Stamatotos, Curr. Opin. Immunol. 24:316-323 (2012))。大部分成熟 BnAbs 具有一个或多个不寻常的特征（长重链第三互补决定区域[HCDR3s]，对于非-HIV-1抗 原具有多反应性，以及高水平的体细胞突变），表明了对其诱导的大量障碍（Kwong and Mascola,Immunity 37:412-425 (2012), Haynes et al, Science308:1906-1908(2005), Haynes et al, Nat. Biotechnol. 30:423-433 (2012), Mouquet and Nussenzweig,Cell Mol. Life Sci. 69:1435-1445 (2012)，Scheid et al，Nature458:636-640 (2009))。尤其 是，CD4bs BnAbs具有极高水平的体细胞突变，表明了复杂或延长的成熟通路（Kwong and Mascola, Immunity 37:412-425(2012), ffu et al,Science 329:856-861(2010), ffu et al，Science 333:1593-1602(2011)，Zhou et al, Science 329:811-817(2010))。此外，难 以发现以高度亲和力与BnAb生殖细胞系或未突变的共同祖先（UCA)结合的Env，其是可作 为用于诱导 BnAbs 的候选免疫原的特征（Zhou et al, Science 329:811-817(2010)，Chen et al, AIDS Res. Human Retrovirol. 23:11 (2008), Dimitrol, MAbs 2:347-356 (2010), Ma et al, PLoS Pathog. 7:e100 2200 (2001), Pancera et al, J. Virol. 84:8098-8110(2010), Xiao et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.390:404-409(2009))。迄今为止已发现 Evn 结合至靶向 gp41 近膜区的 BnAb 的 UCA(Ma et al, PLoS Pathog. 7:e100 2200(2001)，Alam et al, J. Virol. 85:11725-11731 (2011))，以及结合至一些 Vl/V2BnAb 的 UCA(Bonsignori et al, J. Virol. 85:9998-10009 (2011))，但是目前没有发现结合 CD4bs BnAb 世系的 UCA 的异源性 Env(Zhou et al, Science 329:811-817(2010)，Xiao et al，Biochem.Biophys. Res. Commun. 390:404-409(2009),Mouquet et al, Nature 467:591-595 (2010), Scheid et al, Science 333:1633-1637(2011)，Hoot et al，PLoS Pathog. 9:e100 3106(2013))， although Envs that bind CD4bs BnAb UCAs should exist (Hoot et al,PLoS ?&七11(^.9:61003106(2013))，虽然结合0)牝8 81^13此六的￡1^应该存在。
[0005] 百分之八十的异性HIV-1感染通过一种传播/首建（transmitted/founder (T/F)) 病毒建立（Keele et al，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:7552-7557 (2008))。对此病毒的初 始中和抗体反应在传播大约3个月之后产生，并且是株系特异性的（Richman et al，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:4144-4149 (2003), Corti et al, PLoS One 5:e8805 (2010))〇 对于T/F病毒的抗体反应驱使病毒逃逸，以致病毒突变体变得对自身血浆的中和作用 具有抗性（Richman et al，Proc. Natl. Acad. Sci. USA100:4144-4149 (2003)，Corti et al，PLoS One 5:e8805(2010))。该抗体-病毒比赛导致约80%的病人中中和抗体的很 差或受限的特异性；但是，在约20%的病人中，T/F病毒的进化的变异体以相当大的中 和宽度诱导抗体，例如 BnAbs(Walker et al, Nature 477:466-470(2011)，Bonsignori et al, J.Virol. 85:9998-10009(2011), Corti et al, PLos One 5:e8805 (2010), Gray et al, J. Virol. 85:4828-4840(2011), Klein et al, J. Exp. Med. 209:1469-1479 (2012), Lynch et al, J.Virol.86:7588-7595 (2012), Moore et al, Curr.Opin.HIV AIDS 4:358-363 (2009), Moore et al,J.Virol.85:3128-3141 (2011), Tomaraset al, J. Virol. 85:11502-11519(2011))〇
[0006] 存在许多潜在的分子途径，通过这些潜在的分子途径，HIV-1可能进 化，并且具有不同中和特异性的抗体的种类可能确实遵循不同的途径（Wu et al,Science333:1593-1602 (2011), Haynes et al, Nat. Biotechnol. 30:423-433(2012), Dimitrol, MAbs 2:347-356 (2010), Liao et al, J. Exp. Med. 208:2237-2249 (2011))〇 由于初始自身中和抗体反应对于T/F病毒是特异性的（Moore et al，Curr.0pin.HIV AIDS4:358-363 (2009))，可以使一些T/FEnv预先倾向于结合在产生BnAb的稀少病人 中观察到的BnAb的生殖细胞系或未突变的共同祖先（UCA)。因此，尽管中和宽度通常 是直到慢性感染时才被观察到，但是在早期感染中在病毒进化和正在成熟的BnAb世 系之间的相互作用的精确理解可针对最终导致BnAb发展的事件提供洞察力。被研宄 的BnAb至今仅仅已从在慢性感染期间被取样的个体中分离（Walker et al, Science 326:285-289(2009), Burton et al, Science 337:183-186 (2012), Kwong and Mascola, Immunity 37:412-425(2012), Wu et al, Science329:856-861 (2010), Wu et al, Science 333:1593-1602(2011), Zhou et al, Science329:811-817 (2010), Bonsignori et al, J. Virol.85:9998-10009(2011), Corti et al, PLoS One 5:e8805(2010), Klein et al, J. Exp. Med. 209:1469-1479(2012))。因此，从病毒传播时开始的通过广泛中和的发展的病 毒和抗体的进化轨迹还是未知的。
[0007]已提出通过靶向未突变的共同祖先（UCA)、BnAb的推定的天然B细胞 受体开始的疫苗策略，其具有相关的Env免疫原以引发具有最终发展宽度的潜 力的抗体世系0^16七&1，5(^61?^ 333:1593-16〇2(2〇11)，他711686七31，恥七. Biotechnol. 30:423-433 (2012), Scheid et al, Nature 458:636-640 (2009), Chen et al,AIDS Res. Human Retrovirol.23:11 (2008), Dimitrol, MAbs 2:347-356(2010), Ma et al, PLoS Pathog. 7 : e100 2200 (2001) , Xiao et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 390:404-409(2009), Alam et al, J. Virol. 85:11725-11731 (2011), Mouquet et al, Nature467:591-595 (2010))。随后将是用特异性选出以刺激产生BnAb的细胞突变通路 的Env免疫接种。本策略的两个方面都已证明是具有挑战性的，这是因为缺少能够与UCA 相互作用的特异性Env和BnAb的早期中间（I)抗体的知识。
[0008] 本发明至少部分产生于导致来自非洲病人的CH103⑶4bs BnAb克隆性世系CH505 的分离的研宄，其从急性HIV-1感染随着BnAb发展。本研宄显示了 CH103BnAb世系比大 多数其他CD4结合位点BnAb较少地突变，并且可能在早至HIV-1感染14周后就能被第一 次检测到。通过该世系中的抗体的早期自身中和引发了病毒逃逸，但是在表位区域中和附 近的快速和广泛的Env进化在获取定义为异源性病毒的中和的血浆抗体中和宽度之前。 CH103Fab和gpl20核心的共晶结构分析证实了抗体中和的新颖的环结合模式。
【发明内容】
[0009] 本发明主要涉及HIV-1和广泛中和HIV-1抗体。更具体地，本发明涉及HIV-1免 疫原和包括其的组合物。本发明进一步涉及在主体（例如人）中诱导广泛中和HIV-1抗体 的产生的方法，以及适合在该方法中使用的化合物和组合物。
[0010] 本发明的目的和优势将由下列说明而清楚表明。
【附图说明】
[0011] 图1A-1D。在供体CH505中的中和宽度的发展和抗体的分离。图1A，显示的是HIV-1 病毒RNA拷贝和纵向血浆样品与HIV-1YU2核心gpl20、RSC3和阴性对照ARSC3蛋白的反 应性。图1B，使用第136周的PBMC来筛分CD19+、CD20+、IgG+、RSC3+和RSC3 A 371厂记忆B 细胞（〇. 198% )。以橙、蓝和绿点表示的细胞产生mAb CH103、CH104和CH106,如通过索引 筛分来鉴定。图1C，显示的是CH103抗体的HIV-1中和强度和宽度。通过邻接法（neighbor joining method) (NJ tree PHYLIP package software)创建的代表主要循环进化枝的 196 个HIV-lEnvs的邻接系统发育树根据通过CH103的中和病毒的IC50染色。图1D，通过显示 的HIV-1抗体的CH103结合至YU2gpl20的交叉竞争，以及可溶性⑶4-Ig在ELISA中被确 定。
[0012] 图2A-2D。随出现的时间的CH103-克隆家族，VHDJH突变和HIV-lEnv反应性。来 自分选的单个记忆B细胞和焦磷酸测序的V HDJH(图2A)和VJJ图2B)序列的系统发育。使 用DNA序列和http://www. ebi. ac. uk/Tools/phvlogenv/的EBI生物资讯服务器作图，使 用dnaml最大可能性法进行祖先重建。使用邻接法阐明在克隆历史的情况下取样日期和读 数丰富度的一致性。在V H单系进化枝并入单个分支的时点，突变频率显示在右边。分离的 成熟抗体是红色的，来自于焦磷酸测序的序列是黑色的。至被观察的成熟抗体的推断的进 化途径为粗体。图2C，具有推测的中间体的CH103世系（圆圈，11-4、17和18)，突变的V H 位点百分比和时间（蓝色）被表示出来。图2D，抗体对自身CH505(左框）和异源B. 63521 的结合亲和力（Kd，nM)通过SPR测量（右框）。
[0013] 图3A-3D。在复合体中的具有HIV-lgpl20的外部结构域（0D)的抗体CH103的结 构。图3A，具有gpl20多肽的复合体的总体结构用红条带描绘，CH103作为分子表面显示 (重链为绿色，轻链为蓝色）。图3B，被CH103连接的0D (红色）和被CH103连接的核心 gpl20(灰色）的叠加，多肽以条带表现形式显示。图3C，0D (红色）上的CH103表位（绿 色），初始CD4结合位点叠加（黄色边界）在表面表现形式上。图3D，结晶的gpl20的外部 结构域的序列比对显示在第一行，多样的HIV-lEnv被CH103识别。第二结构单元在比对上 用灰色虚线标记，表示无规则区域。黄色或绿色的标志表示gpl200D分别接触⑶4和CH103， 开口圆表示主链接触，带射线的开口圆表示侧链接触，实心圆表示主链和侧链接触两者。
[0014] 图4A-4D。CH103互补位、关键残基和所需的免疫前驱体。图4A，具有CH103的可 变结构域的复合体的总体结构以条带表现方式来描绘，gpl20以分子表面显示。染色方案 与图3A相同。图4B，CH103抗体决定簇表面显示在表面下的多肽带的上部。通过贡献抗体 组分对表面着色和标记。图4C，通过基础残基的成熟状态染色的CH103互补位表面。未突 变的残基染洋红色，而亲和力成熟的残基对重链和轻链分别染绿色和浅蓝色。图4D，CH103 克隆性世系成员的重链和轻链的序列比对。对框架和CDR残基进行标记，对与gpl20相互 作用的残基也标记（开口圆，主链相互作用；带射线的开口圆，侧链相互作用；实心圆，主链 和侧链相互作用两者）。未突变的互补位残基用洋红色突出，成熟获得的互补位残基对重链 以绿色突出，对轻链以蓝色突出。
[0015] 图5。在Ch505Env的关键区域中序列标识表现出变异。每个位点的每个氨基酸变 异体的频率通过其高度表示，缺失以灰色栏表示。第一重现突变N279K在第4周出现（空 心箭头）。BnAb活性发展的时间（从图8和表1)在左边。病毒多样化（在获得宽度之前） 通过每个区域的右边的垂直箭头突出。⑶4和CH103接触残基和基于HIV-1HXB2的氨基酸 位置数目沿着每个标识栏的底部显示。
[0016] 图6A和6B。在CH103克隆性世系中的中和宽度的发展。图6A，系统发育CH103克 隆性世系树，其显示自体同源T/F (C. CH505)、异源等级进化枝A (A. Q842)和B (B. BG1168)病 毒的中和的IC50(微克/毫升）。图6B，进化中的病毒和发展中的克隆性世系（其在CH103 发展的变异体和同时期的病毒的模型中绘图）之间的相互作用。HIV gpl20的外部结构域 以蠕虫表示方式描绘，蠕虫厚度和颜色（白色到红色）描绘了在每个时间点每个位点序列 多样性的程度。抗体中间体的模型以卡通图显示，在每个时间点的体细胞突变在球体中突 出，并对从18至成熟抗体携带的突变着红色，对从14至成熟抗体携带的突变着蓝绿色，对 从13至成熟抗体携带的突变着绿色，对从12至成熟抗体携带的突变着蓝色，对从II至成 熟抗体携带的突变着橙色，对从II的CH103突变着洋红色。直至成熟抗体，并没有一直携 带的短暂突变着深橄榄色。抗体（互补位）残基以表面表现形式显示，并通过如图5中的 其化学类型来着色。
[0017] 图7A和7B。第4周（图7A)和第14周（图7B)的汉明间距（hamming distance) 频率分布。最佳匹配泊松分布的模型以红线显示。使用泊松匹配工具（见如下参考）在来自 于主体CH505的第一个可获得的样品（图7A)中的序列多样性的分析表明，序列与星形系 统发育相一致，并且突变根据泊松分布（适合度P = 〇. 11)积累。这与建立感染的单个首建 病毒一