来源于抗生素溶杆菌oh13的吩嗪类化合物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类来源于抗生素溶杆菌0H13的具有抗细菌活性的吩嗪类化合物及 其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，天然产物作为抗菌药物，已广泛应用于临床医药和农业领域。细菌是天然 产物的重要来源，主要产生菌包括放线菌（Actinomycetales)、芽孢杆菌（Bacillus)、假单 胞菌（Pseudomonas)、粘细菌（Mycobacteria)和蓝细菌（Cyanobacteria)等。
[0003] 溶杆菌（Lysobacterspp.)属于黄单胞科、溶杆菌属。截止2014年底，国际上已 报道的溶杆菌属细菌有32个种，其中产酶溶杆菌（Lysobacterenzymogenes)、抗生素溶杆 菌（Lysobacterantibioticus)和胶状溶杆菌（Lysobactergummosus)对植物病原真菌、 卵菌、革兰氏阴性细菌（G〇、阳性细菌（G+)和线虫都有显著的拮抗作用，是一类新型植物病 害生防细菌。溶杆菌属细菌盛产小分子次生代谢产物，是天然产物新的来源。如，产酶溶杆 菌中已报道可产生抗真菌物质HSAF及抗革兰氏阳性细菌物质WAP。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一类来源于抗生素溶杆菌0H13的吩嗪类化合物及其制备 方法；本发明的另一个目的在于提供吩嗪化合物在拮抗细菌中的应用。
[0005] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006] -种从抗生素溶杆菌0H13发酵液中分离纯化所得的吩嗪化合物，该吩嗪化合物 的结构式如式I~式VI:
[0008] 本发明还提供了一种从抗生素溶杆菌0H13发酵液中分离纯化所得的吩嗪化合物 的方法，该方法包括以下步骤：
[0009] 第一步，抗生素溶杆菌0H13的种子液培养：挑取抗生素溶杆菌0H13菌种划线于 NA培养基上，培养得平板菌种；从所述的平板菌种中挑取单菌落于NB培养液中，培养后得 种子液；
[0010] 第二步，抗生素溶杆菌0H13的发酵培养：将所述的种子液按接种于NB或10%TSB 或R2A培养液中，在转速为180~300pm的条件下发酵20-24h，即得发酵液；
[0011] 第三步，吩嗪化合物的提取：首先将发酵液离心后取上清液，之后将该上清液采用 乙酸乙酯进行浸提萃取，萃取后蒸干乙酸乙酯后再用有机溶剂进行溶解，溶解后挥发掉有 机溶剂，得到粗提物，将该粗提物在< 〇°c的条件下保存待用；
[0012] 第四步，吩嗪化合物的精制：将所述的粗提物溶于有机溶剂后再经葡聚糖凝胶柱 层析分离，甲醇洗脱依次得到组分1~6;其中，组分6为式III所示化合物，组分5用高效液 相色谱进一步分离，得到式I所示化合物、式II所示化合物、式IV所示化合物、式V所示化 合物和式VI所示化合物。
[0013] 本发明技术方案的第一步中，种子液的培养时间为24~36h。
[0014] 本发明技术方案的第二步中，种子液的接种量为1~5%。
[0015] 本发明技术方案的第三步中，有机溶剂为乙酸乙酯或甲醇或氯仿。
[0016] 本发明技术方案的第四步中，所用的有机溶剂为甲醇和丙酮的混合液。在一些技 术方案中，所用葡聚糖凝胶柱层析法的凝胶为LH-20,80g，甲醇等度洗脱，10-15秒/滴。在 一些优选的技术方案中，所用的HPLC纯化条件：
[0017]色谱柱型号：AgilentEclipseXDB_C18column，5ym，9. 4X250mm;
[0018]流速：4mL/min;
[0019]检测波长：274nm;
[0020] 流动相为：0min，20 % 乙腈，80 % 水；5min，45 % 乙腈，55 % 水；19min，50 % 乙腈， 50%水；201^11，60%乙腈，40%水；23-27111111，100%乙腈 ；28-30111111，20%乙腈，80%水。
[0021] 本发明技术方案所述的吩嗪化合物（式I~式VI所示化合物）在制备用于抗菌药 物中应用。
[0022] 本发明技术方案所述的吩嗪化合物（式I~式VI所示化合物）在制备用于防治植 物病原细菌药物中应用。
[0023] 本发明所述的抗生素溶杆菌0H13为本实验室分离于水稻根际土壤的一株革兰氏 阴性细菌。0H13已于2013年05月06日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研宄所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)， 保藏号为CGMCCNo. 7561。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 本发明提供了一种一类来源于抗生素溶杆菌0H13的吩嗪类化合物及其制备方法 及应用，该吩嗪类化合物制备方法简单，抗菌效果明显。
【附图说明】
[0026]图1为吩嗪化合物对不同细菌的拮抗效果图；
[0027] 其中，式I为式I所示化合物，式II为式II所示化合物，式III为式III所示化合物， 式IV为式IV所示化合物，式V为式V所示化合物，式VI为式VI所示化合物，CK为对照。
[0028] 图2为式I所示化合物的紫外吸收图谱；
[0029] 图3为式I所示化合物的屮NMR谱；
[0030] 图4为式I所示化合物的13CNMR谱。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：
[0032] 培养基的配制：
[0033] 10% TSB :3g Tryptic soy broth，1L水，121°C灭菌20min〇
[0034] NB:牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，酵母提取物lg，蔗糖10g，lL水，121°C灭菌20min。
[0035]NA:每 100mLNB培养基加入 1. 7g琼脂，121°C灭菌 20min。
[0036]R2A:酵母粉0. 5g，胰蛋白胨0. 5g，酪蛋白氨基酸0. 5g，葡萄糖0. 5g，可溶性淀粉 〇. 5g，磷酸二氢钾0. 3g，七水硫酸镁0. 05g，丙酮酸钠0. 3g，1L水，利用磷酸二氢钾或磷酸氢 二钾调pH至 7. 2,121°C灭菌 20min。
[0037] 实施例1
[0038] 第一步，抗生素溶杆菌0H13的种子液培养：挑取抗生素溶杆菌0H13菌种划线于 NA培养基上，28°C培养得平板菌种；从所述的平板菌种中挑取单菌落于NB培养液中，28°C 培养24~36h后得种子液；
[0039] 第二步，抗生素溶杆菌0H13的发酵培养：将所述的种子液按照1~5%接种于NB 或10%TSB或R2A培养液中，在转速为220pm的条件下，28°C发酵20-24h，即得发酵液；
[0040] 第三步，吩嗪化合物的提取：将发酵培养液，6000rpm离心20min后去除菌体，取上 清并在上清液中立即加入等体积乙酸乙酯，摇动，使乙酸乙酯与上清充分接触，用分液漏斗 进行分离，收集上层有机相，萃取2-3次直至发酵液无色。合并萃取液，利用旋转蒸发仪，在 38°C条件下旋转蒸发，蒸干后，采用乙酸乙酯或甲醇或氯仿将旋转烧瓶中样品全部溶解，得 到粗提物，溶剂挥发干后保存于_20°C待分离制备。
[0041] 第四步，吩嗪化合物的精制：将上述粗提物利用甲醇+丙酮完全溶解，利用葡聚糖 凝胶柱层析（LH-20)法分离，溶解的粗提物沿凝胶柱壁缓慢加入，以防搅动凝胶，10s/滴， 使粗提物进入凝胶直至与凝胶面相平后，加入甲醇作为洗脱剂，流速调整为15s/滴。待粗 提物运行至凝胶柱底部，利用干净的试管收集洗脱液，40min/管。将试管中洗脱液点TLC 板检测，合并相同组分，依次得到组分1-6。其中，组分1~4舍弃；组分6为式III所示化合 物；组分5浓缩后进行HPLC分离，进样量为95yL，HPLC纯化条件为：色谱柱型号Agilent EclipseXDB_C18column, 5ym，9. 4X250mm，流速为 4mL/min。流动相为：0min，20 % 乙 腈，80 % 水；5min，45 % 乙腈，55 % 水；19min，50 % 乙腈，50 % 水；20min，60 % 乙腈，40 % 水； 23-271^11，100%乙腈；28-30111111，20%乙腈，80%水。检测波长27411111，收集单一峰，得到式 I所示化合物、式II所示化合物、式IV所示化合物、式V所示化合物和式VI所示化合物。
[0042] 式I所示化合物为红色针状晶体，ESI-MS m/z 259. 2[M+H]+，（分子式，C13H1QN204); :H NMR(DMS0, 600MHz) 8 15. 00(s, 1H), 8. 09 (d, 1H), 7. 82 (t, 2H), 7. 71 (t, 1H),7. 31(d, 1H), 7 ? 12(d, 1H), 3. 98(s, 3H) ;13C NMR(CDC13, 100MHz) S 153. 73, 153. 66, 138. 61，135. 84, 132. 45 ,131. 70,