一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病原菌检测技术领域，特别是涉及到一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法。
【背景技术】
[0002]食源性致病菌一直是一个严重的全球健康威胁。在过去十年的中国，微生物导致食物中毒爆发的比例最大(60.4%)。在美国，每年发生约42000宗严重的沙门菌病。由于很多致病菌的感染剂量非常低，所以简单、快速、灵敏、可靠的检测技术对人类生命健康至关重要。然而，基于传统培养的检测方法的灵敏度和分离技术的不足，轻微感染沙门菌的情况下，通常没有被诊断出来，因此实际感染数目是非常大的。开发能大幅提高检测和分离率的新技术成为迫切需求。沙门菌的传统基于培养的检测方法及酶联免疫吸附试验(ELISA)灵敏度低，程序复杂并且工作量大，需要专业人员进行仪器操作，检测所需的人力、物力多。现有技术不能满足日常检测需要，也给实验人员带来了极大的检测困难。
[0003]很多由半导体量子结构所构成现代发光材料和器件不断出现，制造形成的量子点尺寸都与过去常用的染料分子的尺寸接近，其和传统荧光染料一样对生物医学的研宄有很大用途。从生物体系的发光标记物的差异上分析，量子点由于量子力学的奇妙规则而具有显著的尺寸效应，基本上高于特定域值的光都可吸收，而一个有机染料分子只有在吸收合适能量的光子后才能从基态升到较高的激发态，所用的激发光必须是精确的波长。量子点材料要吸收所有高于其带隙能量的光子，但所发射光的波长(具有相应的颜色)又非常具有尺寸依赖性，故单一种类的纳米半导体材料就能够按尺寸变化产生一个发光波长不同的、颜色分明的标记物家族，这是染料分子根本无法实现的。
[0004]荧光分析法由于灵敏度高、选择性好、仪器结构相对简单、价格便宜等特点，已成为化学分析中的常用方法之一。由于能发射出荧光的物质数量不多，那些不能发射荧光的物质常需要与一些荧光配合物或荧光探针等结合才能进行分析测定，从而限制了荧光分析法的直接应用。量子点由于其具有的独特荧光性质，成为科研工作者采用荧光标记法进行生物测定的新型探针材料。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速、灵敏、简便的检测沙门菌的方法。
[0006]本发明用含有培养基的拭子直接采样并培养，通过观测是否产生硫化亚铁形成的黑斑而判断硫化氢反应是否阳性，作出阳性初筛，然后将特异性靶向抗体偶联的量子点纳米颗粒溶液与初筛阳性的拭子孵育，从而实现对靶向菌的特异性结合及荧光观测，通过观测拭子上的量子点偶合物的荧光信号检测靶向菌。
[0007]具体的技术方案是:一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0008]A)含培养基拭子的制作:将适于沙门菌生长的培养基加入用吸水材料所制作的拭子中，晾干备用，其拭子分为棉签状、纸片状两种；
[0009]B)取样培养:使用步骤A处理后的拭子加入定量样本，37°C培养18?48小时；
[0010]C)可疑样品的筛选:肉眼观察拭子生长情况，筛选产生黑色斑点的拭子；然后其放入含沙门菌特异性抗体偶联的水溶性量子点生物探针溶液中，37°C孵育15分钟或者4?8°C低温冷孵育过夜，然后将拭子放于设计的人工荧光观测仪(带特制截止滤光片及荧光激发光源的体视镜)或者激光共聚焦显微镜下观察，或者激光共聚焦显微镜下观察，并提供与量子点相应波长的激发光源，有荧光斑或丝出现者为阳性，且可以判定为标本携带沙门菌；
[0011]D)可直接挑取黑斑、荧光斑的部分培养物，转至鉴别平板培养基上划线分离，获取沙门菌的纯分离株，以供作其它试验用。
[0012]所述拭子为棉签状拭子或者纸片状拭子，所述棉签状拭子，由长25?30mm，宽9?10mm，重0.1?0.2g的100%医疗级脱脂棉纤维和一个14.5cm长的柄构成，将棉签状拭子置于和棉签状拭子相适应的长筒状容器内，添加1.0?2.0ml培养基后于35°C?45°C无菌环境干燥48小时，置于4°C备用；所述纸片状拭子，由长10?15cm，宽2.2?2.8cm的3号层析滤纸片构成，将纸片状拭子折叠后放于密封袋内，添加1.0?2.0ml培养基后于35°C?45°C无菌环境干燥48小时，置于4°C备用。
[0013]所述培养基含有40毫克的多价蛋白胨，5毫克氯化钠，10毫克普通蛋白胨，0.6毫克柠檬酸铁胺，12毫克硫代硫酸钠，0.6毫克亮氨酸，8微克胆盐，补加蒸馏水至I毫升。PH值调至7.4。
[0014]所述方法中步骤C)可以采用人工荧光观测仪进行观测，所述带人工荧光观测仪是在普通体视镜的物镜外层安装一个环形蓝色发光二极管，在二极管外层盖装一个环形光学截止滤光片；光学截止滤光片能够完全遮盖住蓝色发光二极管。
[0015]所述环形蓝色发光二极管的激发光波长为365?405nm ;所述光学截止滤光器截止的发射光波长为400?680nm。
[0016]本发明的有益效果是:本发明将生化反应的初筛作用与荧光纳米生物探针结合起来检测沙门菌，建立了快速检测的方法，配合设计的带截止滤光片及荧光激发光源的体视镜制成的人工荧光观测仪或激光共聚焦显微镜，实现可视化判断结果，可操作性强，适合大批量样品的检测，操作简单、特异性强、准确度高、效率高，可以在一天内完成初筛，两天完成靶向菌的分离。本发明大大减少了人力、物力的消耗，检测效率大大提高，可广泛应用于实际检测工作；所需的拭子、培养基、生物探针均易于制备，适合产业化生产。
【附图说明】
[0017]图1为单克隆抗体共轭的量子点探针的表征:量子点偶合抗体后(Α-a)及偶合前(A-b)凝胶电泳图、水溶性CdSe/ZnS量子点在标准抗体前后的荧光吸收及发射光谱图(B)、单克隆抗体标记的CdSe/ZnS量子点与沙门菌特异性孵育结合的透射电子显微镜观测图(C)；
[0018]图2为人工荧光观测仪的设计图；
[0019]图3为检测沙门菌的方法流程图；
[0020]图4为拭子的生化反应初筛效果图(A)、特制的分离可疑菌株用的弯钩(B)、初筛阳性拭子孵育量子点探针溶液后的肉眼荧光效果图(C-G);
[0021]图5为拭子孵育量子点探针溶液后的激光共聚焦显微镜观测图；
[0022]图6为拭子孵育量子点探针后的扫描电子显微镜检测图:
[0023]图7为模拟样本检测的特异性、灵敏性和检出率(A)、肛拭样本加标检测应用(B-C)。
【具体实施方式】
[0024]为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。
[0025]实施例1应用水溶性氨基化CdSe/ZnS量子点及含培养基的棉签状拭子对曼哈顿沙门菌 Salmonella manhattan 的检测。
[0026]下面以水溶性氨基化CdSe/ZnS量子点及含培养基的棉签状拭子对曼哈顿沙门菌Salmonella manhattan检测为例，对本发明方法进行详细的说明。
[0027]1、拭子的制备方法
[0028]棉签状拭子:长25?30mm，宽9?10mm，重0.1lg的100%医疗级脱脂棉纤维和一个14.5cm长的竹柄的棉签状拭子，能够吸收1000微升培养基或样品溶液。所有定制拭子不含有任何添加剂(如甲醛，消色剂或荧光剂等)。将1000微升配置好的培养基加入到一个和棉签状拭子相适应的长筒状容器内，将所述拭子插入到该容器内，在室温下吸收30分钟，然后将充分吸收了培养基的拭子置于35°C?45°C无菌环境干燥48小时，再置于4°C备用。
[0029]2、培养基的制备
[0030]每毫升培养基中含有40毫克的多价蛋白胨