一种细菌素及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株清酒乳杆菌LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)所产的细菌素， 及利用该微生物生产细菌素的应用。
【背景技术】
[0002] 细菌素是由乳杆菌产生的一种耐高温、耐酸、在人体中可降解、安全无毒，且具有 较强抑菌活性的抗菌短肤。细菌素是由微生物通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活 性的蛋白质或低分子量多肤物质，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素 具有自身免疫性。
[0003]细菌素作为一种特殊的抗菌抑菌蛋白质，具有抑菌活性强、生物相容性好、性能稳 定、可生物降解、可消化吸收、生物安全性高的特点，在预防及治疗畜禽疾病、生产绿色生物 饲料添加剂和生物兽药领域具有广阔的开发应用前景。
[0004]目前已发现多株产细菌素的清酒乳杆菌，该些清酒乳杆菌素的分子量从几千 到几万道尔顿不等，如lactocin27分子量为12400Da，lactacinB分子量为6300Da， plantaricinAMA-K分子量为2900化等，该些细菌素的共同点是，细菌素是一种小分子多 肤，具有蛋白质的一些基本特性。所W蛋白质的分离纯化方法同样适用于乳酸菌细菌素的 分离纯化，但是根据不同的细菌素的特点，细菌素的纯化方法也存在差异，且目前公开的纯 化效果和收率不是很理想。
【发明内容】
[0005] 本发明为了克服现有技术不足，提供清酒乳杆菌LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)所产的细菌素，该菌株发酵生产的细菌素为广谱抗菌素，对革兰氏阴性菌和革兰氏 阳性菌均有抑菌效果；并提供该细菌素的分离提纯方法，得到的细菌素纯度高，收率高。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0007] 一种细菌素，其特征在于，所述细菌素由清酒乳杆菌LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)产生，其中清酒乳杆菌LZ217(Lactobacillus sakei LZ217)保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号CGMCC NO. 10259,保藏地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏时间2014年12月29日。
[0008] 前述细菌素的制备方法，清酒乳杆菌LZ217接种于MRS液体培养基中，37°C静置培 养12h，制得种子液；按5%的接种量接种于MRS液体培养基中，37°C静置培养2化，离屯、去 除菌体，4°C保存备用。
[0009] 优选的，离屯、条件为转速1200化pm，时间20min，温度4°C。
[0010] 进一步，离屯、获得的发酵上清液，首先通过大孔树脂进行粗提，然后先后通过阳离 子交换层析和凝胶过滤层析进行中度纯化；最后通过HPLC高效液相色谱层析进行精细纯 化，得到纯化后的细菌素，冻干保存。
[0011] 优选的，大孔树脂纯化的具体步骤如下：
[0012] 称取30g大孔树脂XAD-1180,用无水己醇浸泡2化使其充分溶胀激活，然后再用去 离子水充分的漂洗，最后再用抽滤瓶抽滤干净备用；
[0013] 将处理过的大孔树脂采用湿法装柱，装入2. 5X30cm的玻璃层析柱中，尽量避免 气泡进入；
[0014] 将1L发酵上清过柱，流速控制在10血/min。持续时间大概lOOmin;
[0015] 用500mL的去超纯水清洗层析柱，去除附着在树脂表面的残留培养液；
[0016] 用200血20%甲醇溶液洗脱层析柱，流速控制在10血/min,再用200血50%的甲醇 溶液洗脱层析柱，流速控制在lOmL/min，，最后再用200mL70%的甲醇溶液洗脱层析柱，大 部分有活性的细菌素在70%的甲醇洗脱液；
[0017] 通过旋转蒸发去除甲醇，得到的浓缩液，-20°C保存备用。
[0018] 优选的，阳离子交换层析的具体步骤为；（1)用超纯水清洗AKTApurifier蛋白纯 化系统和层析柱直至基线平衡；
[0019] (2)用10倍柱体积的50mmol/L醋酸缓冲液平衡阳离子交换层析柱；
[0020] (3)将经XAD-1180提取的粗提液细菌素样品通过系统累进入阳离子交换柱；
[0021] (4)先用5倍柱体积50mmol/L醋酸缓冲液洗脱未结合杂蛋白，洗脱至基线水平；
[0022] (5)接着用含Imol/L化C1的50mmol/L醋酸缓冲液梯度洗脱结合的目标蛋白，流 速为1ml/min，每管3mL收集洗脱液，215nm紫外波长检测蛋白峰，分别检测蛋白质含量和 抑菌活性；
[0023] (6)用10倍柱体积含Imol/L化C1的50mmol/L醋酸缓冲液清洗层析柱，也可用 2mol/L化0H溶液对层析柱进行再生处理，直至基线平衡；
[0024] (7)再用超纯水清洗AKTA-purifier蛋白质纯化系统和层析柱直至基线平衡；
[002引 做将AKTA系统和离子柱保存在20 %的己醇溶液中；
[0026] (9)收集所需组分，真空浓缩保存，W便后续实验。
[0027] 优选的，所述凝胶过滤层析包括W下步骤：
[002引 （1)将经阳离子交换层析后的细菌素样品通过系统累进入凝胶柱中；
[002引 似用1倍柱体积50mmol/L醋酸缓冲液洗脱目标蛋白，洗脱至基线水平。速度为 1ml/min，每管ImL收集洗脱液，215nm紫外检测收集蛋白峰，分别检测蛋白质含量和抗菌 活性；
[0030] (3)将AKTA系统和离子柱保存在20 %的己醇溶液中；
[0031] (4)收集所需组分，真空浓缩保存。
[0032] 优选的，所述高效液相色谱层析包括W下步骤：
[003引 （1)制样；取一定量的经凝胶层析后的细菌素溶解于溶解液中，用0. 45um微孔滤 膜过滤后，备用；
[0034] 似上样；(：18色谱柱用甲醇冲洗3〇111111，65%己膳+35%水溶液洗脱3〇111111，流动 相A洗脱平衡30min，微量进样针吸取20y1进样；
[003引 做梯度洗脱；洗脱时间为40min，洗脱梯度为0%B-100%B，流速为Iml/min，检 测紫外波长为215nm，收集各个洗脱峰，分别测定蛋白质含量和抑菌活性；
[0036] (4)色谱柱再生：甲醇冲洗C18色谱柱30min，超纯水清洗30min，保存液清洗 20min。
[0037] 前述细菌素在制备食品和饲料防腐剂或绿色生物兽药的应用。
[0038] 前述细菌素在制备细菌抑制剂中的应用，所述细菌为巧樣色葡萄球菌、单增李斯 特氏，藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌。
[0039] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种细菌素，所述细菌素由一株产细 菌素清酒乳杆菌LZ217产生，命名为细菌素LZ217。
[0040] 本发明的清酒乳杆菌LZ217菌株产生的细菌素能够有效抑制多种食品腐败和致 病革兰氏阳性细菌。其抑菌谱很广，其中对巧樣色葡萄球菌、单增李斯特氏的抑制作用非常 明显，对藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌等致病菌也有较强的抑制 作用，抑菌谱包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，属于广谱性细菌素。
[0041] 采用本发明提供的细菌素的分离提纯方法，步骤相对来说操作简单且快速，过程 较短，可W很好的分离纯化本发明的细菌素LZ217,并可避免细菌素在长时间的处理下变性 失活，收率高，纯度高。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0043] 实施例1;
[0044] 清酒乳杆菌LZ217的分离
[0045] 取生鲜牛乳用0.9 %的生理盐水W10倍梯度稀释，将每个稀释梯度分别吸取 0. 3ml涂布于含清酒乳杆菌LZ217筛选培养基的平板上，37°C倒置无氧培养36~4她。选 择长势良好形态不同且巧溶圈大的菌落进行编号，并通过平板划线分离法反复分离纯化， 挑取平板上的清酒乳杆菌LZ217单菌落，接种到MRS液体培养基中，37°C恒温培养2化，然后 编号保种，一80°C保藏菌株。
[0046] 产