一种glp-1衍生物的制作方法
【专利说明】-种GLP-1衍生物
[0001]
技术领域： 本发明设及膜高血糖素样肤-1 (GLP-1) (7-37)衍生物及其药学上可接受的盐，W及 设及其一些治疗用途。
[000引【背景技术】； 膜高血糖素样肤-1 (GLP-1)是肠促膜岛素的一族，由肠道L细胞分泌，是一种在餐后 分泌的激素、有助于控制血糖，可W作为2型糖尿病治疗的一个重要祀点。但是GLP-1在体 内迅速被一种酶值PP-4)所降解，在体内的血浆半衰期（tl-2分钟。该种代谢不稳定性限 制了天然GLP-1的治疗效能。因此，需要一种较天然GLP-1更有效或代谢上更稳定的GLP-1 衍生物。
[0003]DPP-4酶抑制剂，对DPP-4有抑制作用，能提高和延长GLP-1的激素活性，从而刺激 膜岛素的释放，减少膜高血糖素的分泌。该两种作用都有利于2型糖尿病患者血糖高水平 的调节。
[0004] 本发明通过对GLP-1 (7-37)的结构进行改造，并在侧链上引入DPP-4酶抑制剂， 能够得到比天然GLP-1代谢上更稳定的GLP-1衍生物。
[0005] 化合物特征： 一种GLP-1 (7-37)或与GLP-1 (7-37)相比有最多达8个氨基酸改变的GLP-1 (7-37) 类似物的衍生物，所述GLP-1 (7-37)类似物具有人GLP-1的功能，其特征在于所述衍生物 中的N端氨基、侧链氨基、侧链駿基、C端駿基、组氨酸侧链咪挫基中至少一个与一种具有式 (I)的缀合物缀合； K1-K2 (I) 其中K1为包含DPP-4酶抑制剂的修饰基团，K2为间隔物，并且K2末端与主链缀合；K1优选为：
2-畑2为DPP-4酶抑制剂【包含Sitagliptin(简写为SiXVildagliptin(简写为VI)、Saxagliptin(简写为SA)等】； n为0-14的整数； X是C、N或0 ; Y是0或S; R优选为：
K2优选为W下通式所描述的化合物： ① （AEEA)a-Xaa7-Xaa8 -Xaa9 - (AEEA)b 上述所设及的AEEA{[2- (2-氨基）己氧基]己氧基己酸}结构为
a为0-8的整数；b为0-6的整数； Xaa7 选自；Glu、Gin、Phe、Tyr或缺失； Xaa8选自；Asn、Asp、T虹或缺失； Xaa9 选自；Lys、Asn、Ser、切s或缺失； ② -(邸2)pCO-XaalO-，为直链或分支脂肪酸的酷基与氨基酸残基相连 上述所设及的P为4-30的整数； XaalO选自；Glu、Asp、Gln或缺失； 化合物结构示例：
权利要求书和说明书中所使用的缩写的含义列于下表中；
2、制备方法 (1) 缀合物的制备方法 ①K1的制备； A) 称取SI(leq)和了二酸酢（leq)，用冰醋酸（2mol/L)溶解，50°C反应过夜； B) 反应液加入己酸己醋中，用水洗掉醋酸，浓缩，烘干，得到产品； ②K1-K2的制备； A) 按照所需要的K2,用固相合成的方法合成K2 ; B) 继续固相偶联K1 ; C) 将肤树脂切割，处理，得到缀合物； (2) 主链的制备方法 A) 2-CTC树脂用DCM洗漆2-3次，用DCM溶胀； B) 称取N端Fmoc保护的氨基酸（3eq)，用DCM溶解(氨基酸浓度为0. 3mol/L)，加入 DIEA(3eq)，活化5分钟，加入反应柱，于25-30°C反应20-2化； C) 用嗽晚和DMF体积比为1:4的混合液（DBLK)脱除Fmoc保护基20分钟； D) 重复步骤A、B、C，但是缩合剂改为HOBt(3. 3eq)和DIC(3. 3eq)，溶剂改为DMF，0-5°C 活化5分钟，加入反应柱，于25-30°C反应2.化，按照所述的氨基酸序列，逐个偶联相应的氨 基酸，并将需要连接缀合物的侧链駿基做成节醋，继续偶联直到序列中最后一个氨基酸偶 联完成； E) 得到的树脂用切割液（TFA和DCM体积比为1:99)切割，将多肤从树脂上切割下来， 用水洗掉溶液中的TFA，浓缩，得到切割的主链粗肤；或将树脂用TFA裂解，将多肤从树脂上 切割下来，并脱掉所有侧链保护基，己離沉淀，得到裂解的主链粗肤； (3 )侧链駿基、C端駿基和缀合物的连接方法 A) 用氨解的方法脱除切割的主链粗肤的侧链駿基保护基苄基； B) 在駿基上偶联Boc-己二胺，称取Boc-己二胺（1.leq)，降温至-5-0 °C，加入 DCC(leq)，投料，室温反应过夜； C) 用TFA裂解样品，己離沉淀，得到粗肤； D) 称取缀合物（leq)，将其合成为活性醋； E) 称取粗肤（leq),溶于S己胺中，调整抑为9-11，加入缀合物活性醋，室温反应 20min，加水终止反应，调抑为7-8,得到缀合物连接的粗肤； (4)、N端氨基、侧链氨基、组氨酸侧链咪挫基和缀合物连接的方法 A) 称取缀合物（leq)、将其合成为活性醋； B) 称取裂解的主链粗肤（leq)，溶于S己胺中，调整抑为9-11，加入缀合物活性醋，室 温反应20min，加水终止反应，调抑为7-8,得到缀合物连接的粗肤； (5)、纯化方法 A) 用C18色谱柱，W0. 1%TFA水溶液为流动相A，己膳为流动相B，线性梯度洗脱，梯度 为30min内流动相B的体积比例从30%升至70%，收集馈分，冻干得到最终产品； B) 用HPLC方法检测其纯度和含量，用质谱仪和E血an降解分析其序列； 4、 所使用的仪器设备 多肤合成仪；美国CsBioCS336X研究用多通道多肤合成仪； HPLC;日本岛津LC-15C高效液相色谱； 色谱柱：YMC-Pack 0DS-A-服lOum200A4.6mm*250mm; 质谱仪；AB SCIEX5800MALDI-TOF-TOF ; 5、 含义说明 (1)膜高血糖素样肤1 (GLP-1)是由肠道内分泌L细胞分泌的一种十分重要的肠促膜 岛素，其在体内的主要生理学作用包括进食后刺激膜岛素的分泌和释放，促进膜腺0细胞 的增殖并抑制其调亡，抑制膜高血糖素的分泌，抑制胃的排空，促进饱食感产生等。
[0006] (2)GLP-1(7-37)肤序为；HAEGT-FTSDV-SSYLE-EQAAK-EFIAW-LVKGR-G (3)DPP-4是一种细胞表面的丝氨酸蛋白酶。可溶性的DPP-4具有酶活性，其主要作用 是优先将氨基末端第2个氨基酸为丙氨酸或脯氨酸的寡肤的氨基末端前两个氨基酸剪切 去除。
[0007] (4)类似物：设及多肤的术语"类似物"是指母体肤的一个或多个氨基酸残基被另 一个或多个氨基酸残基取代，和/或母体胎的一个或多个氨基酸残基缺失，和/或向其中母 体肤添加了一个或多个氨基酸残基。
[000引（5)衍生物：设及多肤的术语"衍生物"表示经化学修饰的肤或其类似物，其中至少 一个取代基不存在于未经修饰的肤或其类似物中，即表示已经经共价修饰的肤。
[0009] (6)本发明中所指的"缀合物"是指可与多肤W共价的形式连接的修饰基团，所述 的缀合物包括但不限于上文所述的例子。
[0010] (7)本发明的肤可W是药学上可接受的盐的形式。该些盐例如包括，但不限于，醋 酸、乳酸、马来酸、巧樣酸、苹果酸、抗坏血酸、班巧酸、苯甲酸、甲横酸、甲苯横酸。制备本发 明肤的盐的典型方法在本领域是公知的，它可通过标准的盐交换法来完成。
【附图说明】 图1为本发明制备工艺流程图。
[0011] 实施例一；GLP-1衍生物的合成 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-A la-Lys{ N-e-{ N-a-【SI-C0-(細2) 2-C0-(AEEA)2】-Glu-y-(AEEA)3} }-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly- Arg-Gly 缀合物中间体一【（SI-C0-(CH2)2C00H)】的制备； 称取SI90mg和了二酸酢22mg，用冰醋酸溶解，50°C反应过夜； 然后用化C监测反应情况(氯仿；甲醇；醋酸=5 ; 1 ;2d)，反应转化率达到95%w上后，向 反应液中加入己酸己醋，用水洗掉醋酸，己酸己醋层加入无水硫酸钢干燥后，抽滤，收集滤 液，减压真空浓缩成油状，加入石油離结晶后，过滤，收集固体，固体在40°C鼓风烘干，得到 产品lOOmg，收率约90%，HPLC检测纯度为99%。得到缀合物中间体一； 缀合物【N-a-【SI-C0-(邸2) 2-C0-(AEEA) 2】-G1u-丫-(AEEA)3】的制备： 2-CTC树脂（替代度0. 25mmol/g) 265mg用D