用于将uc-msc转化为胰岛细胞的诱导液及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物工程、组织工程和生物医药领域，特别设及用于将UC-MSC诱导转 化为膜岛细胞的诱导液。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是膜岛素分泌相对或绝对不足或膜岛素受体等缺陷引起的糖、脂肪和蛋白 质代谢素乱性疾病。临床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射膜岛素来治疗。而细 胞治疗是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治疗策略，尤其对于已经丧失膜岛细胞功能的糖 尿病患者来说，植入能分泌膜岛素的膜岛细胞或其替代物是最理想的治疗方法。目前，膜岛 细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难 极大的限制了该种疗法的应用。
[0003] 干细胞具有极强的自我更新能力及多向分化潜能，是基因治疗的理想祀细胞。干 细胞分为全能干细胞（如胚胎干细胞，可W分化为机体所有组织细胞）、多能干细胞胞（具 有多向分化潜能，可W分化为多种组织细胞，如间充质干细胞等）和专能干细胞（维持某一 特定组织细胞的单一方向自我更新，如肠上皮干细胞等）。干细胞技术的不断突破及干细胞 本身所具有的特性使人类有可能在体外培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的 各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织工程W供临床所需，W此为目的的干细胞工程设 及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的大多数医学难题，如屯、血管疾病、糖尿病、恶性 肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于 人羊水、厮带血、外周血和骨髓中的多能干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优 点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的 作用。
[0004] 对干细胞进行适当的基因修饰，使之成为能分泌膜岛素的细胞，是治疗I型糖尿 病的理想策略之一，而将干细胞分化为膜岛细胞过程中，诱导液起到至关重要的作用，针对 干细胞不同的诱导方式，所需要的诱导液不同。然而，现有技术中最常用的诱导干细胞分化 为膜岛细胞的方法为应用插入式细胞培养皿共培养板体外诱导UC-MSC(即厮带间充质干 细胞）向膜岛样细胞分化具体为；选取第3代UC-MSC，用含10%FBS(胎牛血清）的L-DMEM 培养基重悬细胞，调整细胞密度为1X105个/ml，接种于普通6孔板，倒置显微镜下观察细 胞贴壁后，改为L-DMEM/RPMI1640(1:1)培养基（低糖型改良杜氏伊格尔培养基与RPMI 16401:1混合而成的培养基）；同时将已分离获得的膜岛细胞，W50个/孔接种于共培养板 的中，进行UC-MSC和膜岛细胞两种细胞的共培养。然而，此种共培养方法不仅需要一定的 膜岛细胞源，过程较繁琐，花费较大，而且所获得的更多为散在膜岛样细胞，数量较少，膜岛 细胞团几乎没有，而且散在的膜岛样细胞相对较小，膜岛素分泌量少难W达到临床移植要 求。目前，也有研究者正在研究一种将UC-MSC直接诱导成膜岛细胞的方法，因此，迫切需要 一种用于将UC-MSC直接诱导成膜岛细胞的诱导液。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中诱导液诱导UC-MSC与膜岛细胞 共培养方式所获得的膜岛细胞较小，数量较少，且花费较大等缺陷，提供一种可将UC-MSC 转化为膜岛细胞的诱导液。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；一种用于将UC-MSC转化为膜岛细 胞的诱导液，所述诱导液包括巧克酷胺和碱性成纤维细胞生长因子。
[0007] 在本发明提供的UC-MSC转化为膜岛细胞的方法中，所述诱导液中巧克酷胺的浓 度为5-15mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5-15yg/L。
[000引在本发明提供的UC-MSC转化为膜岛细胞的方法中，所述诱导液中巧克酷胺的浓 度为lOmmol/l，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10yg/L。
[0009] 在本发明提供的UC-MSC转化为膜岛细胞的方法中，所述诱导液中巧克酷胺的浓 度为5mmol/l，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5yg/L。
[0010] 在本发明提供的UC-MSC转化为膜岛细胞的方法中，所述诱导液中巧克酷胺的浓 度为15mmol/l，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15yg/L。
[0011] 本发明进一步保护上述诱导液在UC-MSC转化为膜岛细胞中的应用。
[001引实施本发明提供的用于将UC-MSC转化为膜岛细胞的诱导液，可W达到W下有益 效果；该诱导液能够促进UC-MSC增大和增殖转化，促进UC-MSC转化成膜岛细胞团W及增大 膜岛细胞，对于改善现有UC-MSC与膜岛细胞共培养获得膜岛细胞的方法具有重要的意义； 由本发明提供的诱导液在UC-MSC转化为膜岛细胞过程中的应用可知，本发明提供的诱导 液不仅省去现有诱导方法中前期获取膜岛细胞的过程，而且使得UC-MSC转化成的膜岛细 胞数量较多，且膜岛细胞质量较好，能够分泌较多的膜岛素。
【附图说明】
[0013] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0014] 图1为采用本发明提供的诱导液诱导UC-MSC转化成的膜岛细胞通过双硫腺染色 得到的显微镜下的细胞分布图；
[0015] 图2为采用本发明提供的诱导液诱导UC-MSC转化成的膜岛细胞通过双硫腺染色 得到的显微镜下的细胞分布放大图。
【具体实施方式】
[0016] 为解决现有技术中诱导液诱导UC-MSC与膜岛细胞共同培养方式所获得的膜岛细 胞较小，且数量较少等缺陷，本发明的创新点在于提供一种可促进UC-MSC转化成膜岛细胞 的诱导液，该诱导液可促进细胞增殖、增大，从而实现了提高UC-MSC转化率及提高转化后 膜岛细胞质量的目的。
[0017] 具体地，本发明提供的用于将UC-MSC转化为膜岛细胞的诱导液包括：巧克酷胺 和碱性成纤维细胞生长因子，优选地，巧克酷胺的浓度为5-15mmol/L和碱性成纤维细胞生 长因子的浓度为5-15yg/L。巧克酷胺的主要作用是参与呼吸链，参与细胞增殖转化的呼 吸过程及电子传递过程，促进细胞的增殖转化；碱性成纤维细胞生长因子可促进细胞加速 增殖，细胞体积增大，因此，本发明提供的诱导液能够促进UC-MSC的增殖转化，同时，促进 UC-MSC细胞和膜岛细胞体积的增大。
[001引采用本发明提供的诱导液将UC-MSC转化为膜岛细胞的方法步骤为：
[0019] 取第S代UC-MSC，置于培养箱中，并按W下步骤对第S代UC-MSC进行诱导：
[0020] 1)在细胞培养基中加入第一种诱导液，培养至细胞完成增殖过程，获得预转化干 细胞体；
[0021] 2)在含有质量分数为1%-5%的膜岛素-转铁蛋白-砸的DMEM/F12培养基中，加 入第二种诱导液，培养上述预转化干细胞体至细胞转化结束，获得膜岛细胞液；
[0022] 其中，第一种诱导液为5-15mmol/L巧克酷胺、15-30yg/L表皮生长因子、60yg/ L-150yg/Le-神经生长因子和1-lOnmol/L激活素A、5-15yg/Le-琉基己醇；
[0023] 第二种诱导液包括5-15mmol/L巧克酷胺和5-15 y g/L碱性成纤维细胞生长因 子；
[0024] 含有膜岛素-转铁蛋白-砸的DMEM/F12培养基可促使预转化干细胞体定向转化 成膜岛细胞。
[0025] 与现有技术相比，采用本发明提供的诱导液，能够对UC-MSC分步进行转化，使得 UC-MSC可直接转化成膜岛细胞，而无需将UC-MSC与膜岛细胞共培养获得转化后膜岛细胞， 并且采用本发明提供的诱导液可促进UC-MSC细胞的增殖和增大，促进膜岛细胞团的形成， 提高膜岛细胞的转化率。
[0026] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用W解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0027] 实施例1
[002引在本发明提供的UC-MSC转化为膜岛细胞的方法包括W下步骤：
[0029] (1)UC-MSC的分离培养
[0030] 无菌条件下取足月妊娠剖宫产健康胎儿的厮带，厮带离体后浸泡于每毫升含25U 肝素钢的生理盐水中进行4-化处理后，超净台内剔除厮带的动静脉，剥去外层羊膜，将厮 带切成ImmXImmX1mm大小的组织块并贴于培养皿底，加入含体积分数为10%胎牛血清的 低糖DMEM置于37°C、5%C02饱和湿度培养箱中进行培养，培养2周后移除，待贴壁细胞达 到80% -90 %汇合时进行传代培养。
[0031] 其中，含体积分数为10 %胎牛血清的低糖DMEM(