一种提高杜仲含胶量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及了一种提高杜仲含胶量的方法，具体设及通过特定基因导入而提高杜 仲含胶量的方法。
【背景技术】
[0002] 杜仲巧ucommiaulmoidesOliv.)是我国特有的名贵药用树种，且树皮、根、茎、 叶、花和果实中等各组织中均含有大量的白色丝状物质-杜仲橡胶巧ucommiaulmoides RiAber，抓时，因此杜仲被誉为优质的天然橡胶树种。橡胶是我国重要的战略物质资源，橡 胶工业是我国国民经济最重要的基础产业之一。=叶橡胶在我国适生区域很窄，产能已达 极限。国内天然橡胶需求量远远超过国内产量，天然橡胶资源的匿乏制约我国橡胶产业的 发展，因此开发第二天然橡胶资源迫在眉睫。杜仲橡胶是杜仲次生代谢途径产生的祗类高 分子化合物，与=叶橡胶不同，杜仲橡胶的结构是反式聚异戊二締，独有"橡胶-塑料二重 性"，其低温可塑性、热弹性、共混性、高绝缘性和耐腐蚀性方面远远超过了 =叶橡胶，用杜 仲橡胶改性的橡胶组合物，具有耐磨、耐腐蚀、节能等优点，可广泛应用于橡胶工业、航空航 天、军工、船舶、化工、医疗等多个领域。但由于杜仲叶片含胶量低，导致生产成本居高不下， 成为杜仲橡胶产业化的瓶颈。
[0003] 提高杜仲橡胶产量的最根本的途径就是揭示杜仲橡胶的生物合成过程中的基 因调控机理。杜仲橡胶作为一种高分子量反式聚异戊二締，是在一种特殊的异戊締基转 移酶作用下将低分子量反式异戊二締不断缩合而形成的，而低分子量异戊二締的生物 合成是通过异戊締基焦磯酸（IP巧和二甲基丙締基焦磯酸值MAP巧的不断缩合而形成 (Nishibe-S.Bioactivelignansandflavonoidsfromtraditionalmedicines[J]. PolyphenolstheInternationalConference, 1995, 113-122.)。目前，已经鉴定出若 干个参与反式橡胶生物合成的基因，如重要的橡胶蛋白编码基因（MLP)、橡胶延伸因子 (RFF)、橡胶颗粒膜蛋白（RPMP)、小型橡胶颗粒蛋白（SRP巧、反式异戊締基焦磯酸合酶基 因（TIDS)等（MichelRohmer.Thediscoveryofamevalonate-independentpathway forisoprenoidbiosynthesisinbacteria,algaeandhigherplants[J].Nat.Prod. Rep, 1999, 16:565-574.LytleBL等，StructuresoftwoArabidopsisthalianamajor latexproteinsrepresentnovelhelixgripfolds[J].Proteins, 2009, 76:237-243. NesslerCL等，Organizationofthemajorlatexproteingenefamilyinopium po卵y[J].PlantMolBiol, 1992, 20:749-752.NobuakiSuzuki等，Constructionand analysisofESTlibrariesofthetranspolyisopreneproducingplant,Eucommia ulmoidesOliver.Planta[J]. 2012,DOIIO. 1007/s00425-012-1679-x.)。虽然对杜仲橡胶 合成相关基因进行了克隆和基因转化，但尚未揭示相关基因的应用方法。本发明筛选出了 杜仲橡胶合成的关键酶基因，并设计了转基因的浸染方法，从遗传水平上大幅度提高杜仲 橡胶含量。该方法简单易行，提高了新生周皮的含胶量，对降低杜仲橡胶生产成本，促进杜 仲橡胶产业的快速发展，满足我国橡胶产业的需求具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 为了在一定程度上解决上述问题，本发明的目的在于利用基因表达规律和杜仲橡 胶合成规律，提出了一种杜仲橡胶关键酶基因，并通过遗传转化浸染方法将该基因转化至 杜仲中，获得转基因植株并通过生物学功能验证，表明本发明克隆的化TIDS5基因显著增 加杜仲的含胶量，即本发明提供了一种提高杜仲含胶量的方法。
[0005] 为了实现W上目的，本发明采用W下技术方案：
[0006] 根据植物基因克隆技术克隆化TIDS5基因，利用Real-TimePCR检测该基因在不 同时期不同组织的表达，利用索氏提取方法提取杜仲橡胶，分析杜仲橡胶合成规律，从而确 定杜仲橡胶合成的关键酶基因为化TIDS5。利用农杆菌介导的遗传转化杜仲，并将获得的 转基因植株经生物学功能验证，表明本发明克隆的化TIDS5基因具有调控杜仲橡胶合成的 功能。本发明的实施案例部分，将详细描述橡胶合成的关键酶基因EUTIDS5基因的分离克 隆，表达规律W及功能验证的方法。
[0007]EUTIDS5基因可W来源于我国常见的杜仲品种，例如可W为下表所列的品种：
[000引
[0009] 本发明一方面是提供了一种提高杜仲含胶量的方法，包括W下步骤：
[0010] 1)将杜仲树皮初皮部剥皮成多个格子，成间隔隔状露出表面的形成层；
[0011] 2)进行浸染操作；将挑取含有化TIDS5重组表达载体的农杆菌单菌落培养的菌 液，侵染杜仲剥皮的表面形成层；
[0012] 3)剥皮侵染后用塑料膜包裹剥面，保湿防晒生长。
[0013] 进一步地，所述的格子的单格面积为2-lOcm2,更优选为3-6cm2,所述格子可W为 各种形状，作为一个优选的实施例为2cmX2cm方格。
[0014] 进一步地，步骤2)所述的菌液的ODe。。值为0. 5~0. 9。
[0015] 进一步地，步骤3)塑料膜包裹剥面时间为20~100天，例如可W为20天、40天、 或50天、或60天、或70天、或80天、或90天、或100天，更优选为30~90天，进一步优选 为40~80天。
[0016] 进一步地，步骤2)的浸染操作进行2-5次，每次间隔2-4天，优选浸染操作进行3 次，每次间隔3天。
[0017] 进一步地，所述含有重组表达载体的农杆菌单菌落是通过如下方法获得；将含有 EuTIDS5的质粒加入带根癌农杆菌菌株GV3101感受态细胞中，轻柔混合后加入到预冷电 击转化杯中进行电击转化；电击转化后，将带有质粒的感受态细胞质加入培养基，培养；取 液，均匀涂在含有相应抗生素的固体培养基上，倒置培养；挑取单菌落摇菌，摇菌至生长对 数期。一个优选的实施例为：将1yL含有化TIDS5的质粒加入带根癌农杆菌菌株GV3101 感受态细胞中，轻柔混合后加入到预冷电击转化杯中进行电击转化；电击转化后，将带有质 粒的感受态细胞质加入200yL液体培养基，28°C，ISOrpm，培养化；取100yL菌液均匀， 均匀涂布到含有相应抗生素的固体培养基上，28°C倒置培养4她；挑取单菌落摇菌，28°C， 180巧m，摇菌2化至生长对数期。
[001引进一步地，所述含有化TIDS5的质粒的制备方法是：通过PCR的方法扩增 化TIDS5,连接质粒转化培养后提取得到含有化TIDS5的质粒。一个优选的实施例为；通过 PCR的方法进行克隆，所述克隆的PCR体系见下表：
[0019]
[0020] PCR克隆反应条件为；98°C预变性Imin;98°C变性10s，55°C退火15s，68°C延伸 2min，8 个循环；98°C变性 10s，68°C延伸 2min，32 个循环；68°C延伸lOmin;
[0021] 连接反应产物转化至大肠杆菌，并提取质粒。
[002引 进一步地，EUTIDS5的编码序列如SEQIDN0:2所示。
[002引进一步地，PCR扩增化TIDS5的上游引物巧' -3'）和下游引物巧' -3'）分别如SEQ IDN0:3和4所示。
[0024] 本发明的优点为；能够显著提高杜仲含胶量。
【附图说明】
[0025] 图1;不同时期杜仲叶片和果实含胶量。
[0026] 图2 ;杜仲叶片和果实在不同时期化TIDS5的表达量。
[0027] 图3;不同时期杜仲叶片中化TIDS5相对表达量和含胶增长速率的规律。
[002引图4 ;不同时期杜仲果实中化TIDS5相对表达量和含胶增长速率的规律。
[0029] 图5 ;转基因烟草植株PCR检测电泳图。
[0030] 图6 ;转基因烟草不同株系35s: :EuTIDS5的相对表达量。
[0031] 图7;杜仲树皮的转化。
[0032] 图8;转基因树皮表型分析。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行描述，W便本领域技术人员更好的 理解本发明，并在不偏离本发明精神和范围的情况下，可W对本发明做出各种改变和修改， W使其使用不同的用途和条