糙皮侧耳发酵液的制备方法及该发酵液在降解黄曲霉毒素b1中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物发酵，特别是指一种趟皮侧耳发酵液的制备方法及该发酵液在 降解黄曲霉毒素Bi中的应用。
【背景技术】
[0002] 趟皮侧耳俗称平茹，是一种形成子实体的真菌，其生长环境不同分为野生和人工 栽培两种。因子实体中含有丰富营养成分可W食用，又称为食用菌。由大量测定数据得知， 每100克干茹中约含有粗蛋白20克、粗脂肪4克、碳水化合物50克、粗纤维6克，还含有矿 物质、多种维生素和多种微量元素等。其蛋白质含量是鸡蛋的2. 6倍，猪肉的4倍；碳水化 合物含量占总量的65. 61 %，其中还原糖占54. 73% ;氨基酸约有18种，其中人体必需的8 种氨基酸含量较高，占氨基酸总量的35%W上，尤其作为病人的营养品为佳。
[0003] 中医学认为，平茹性平，味甘，具有补虚、抗癌的功效，能改善人体新陈代谢，增强 体质，调节植物神经。平茹含有多糖体，对肿瘤细胞有很强的抑制作用，且具有免疫特性。平 茹还有追风散寒、舒筋活络的作用，可治腰腿疼痛，手足麻木，经络不适等症，此外，平茹还 对肝炎、慢性胃炎、胃及十二脂肠溃瘍，软骨病、高血压等都有疗效，对降低血胆固醇和防治 尿道结石也有一定疗效，对女性更年期综合症可起到调理作用。
[0004] 趟皮侧耳菌在含有营养的固形物上生长可W形成子实体供食用，还可进行菌丝深 层液体发酵，培养液中分泌有大量多糖、酶、氨基酸及生理活性物质。多糖W酸性多糖为主， 含有0-1，3-葡聚糖，半乳糖，甘露糖，葡萄糖醒酸等。经科学研究证实，液体发酵复合产物 对肉瘤S180抑制率为91 %，提取的糖蛋白对体外S180有较强的抑制作用。趟皮侧耳糖肤 组分有促进淋己因子激活杀伤（LAK)细胞和自然杀伤（NK)细胞杀伤肿瘤作用。还具有降 血脂及防治动脉粥样硬化，可明显减轻血清及肝胆固醇和甘油=醋。在发酵液中的多种酶， 尤其种酪氧化酶含量较高。该些酶可用于食品保鲜和稳定，可催化多项化学反应，改变 原分子结构合成新物质，改变分子物质化学性质，利用该一特点进行污水处理保护环境。
[0005] 黄曲霉毒素是一类对人和动物毒性极强物质，是黄曲霉和寄生曲霉菌生长过程中 的次级代谢产物。1993年被世界卫生组织（WHO)癌症机构划定为1类致癌物。产生黄曲霉 毒素的真菌普遍存在于自然界的±壤、农作物及果实、牧草、饲料中，特别在大豆、稻谷、玉 米、花生中，在牛奶及奶制品中也经常检出其毒素。在每年的夏秋季节，温度较高，空气湿度 大，粮食作物在成熟前期很容易被霉菌污染，尤其是病变早熟的种粒极易生长霉菌并产生 霉菌毒素。人食用后可直接危害生命，动物采食后危害动物生命或降低动物生产性能。人 接触黄曲霉毒素的主要来源是膳食污染的食物，污染食物有两种类型，一是由被黄曲霉毒 素污染的植物种子食物中摄入；二是被黄曲霉毒素污染的饲料进入畜、禽体内再转入奶、蛋 及肉制品中被人摄入，最终危害人类生命健康。高秀芬等人在2010年抽查了吉林、河南、湖 北、四川、广东、广西6省的玉米饲料样品279份，黄曲霉毒素阳性率为75. 63%，平均浓度 44. 04yg/kg，浓度范围0. 20-888. 30yg/kg;四川农大张自强2008年-2009年测定了全国 n个省份共计1013份饲料样品，其中黄曲霉毒素Bi(AFBi)检出率高达99. 51 %，尤其W棉 稍、菜稍、玉米含量较高。
[0006] 黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织的破坏作用，发生肝炎，肝硬化，严 重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食物中W黄曲霉毒素Bi最多见，其毒性和致癌性 也最强。经研究得知，黄曲霉毒素Bi大鼠的半致死量雄性（lOOg)为7.2毫克/公斤体重、 雌性（150g)为17. 9毫克/公斤体重，属特剧毒的毒物范围（它的毒性比氯化钟大10倍， 比祗霜大68倍）。中毒后临床表现有胃部不适，食欲减退，恶心呕吐，腹胀及肝区触痛等， 严重者出现水肿，昏迷，抽摇而死。黄曲霉毒素Bi(AFBi)是目前发现的最强致癌物，其致癌 力是奶油黄的900倍，比二甲基亚硝胺诱发胃、肾、直肠、乳腺、卵巢及小肠等部位癌变几率 高75倍。黄曲霉毒素Bi(AFBi)与其它有毒无机化合物，如氯化钟的毒性相比，其毒性机理 更为复杂，它主要是通过抑制核酸和蛋白合成，干扰糖类、脂类代谢，抑制免疫，降低激素活 性，抑制细胞ATP合成等，从而导致碳水化合物和脂类代谢及蛋白合成的抑制，使细胞失去 活性，造成中毒。所W它又是一种细胞毒素。为此，黄曲霉毒素Bi危害已经成为人们关注 的焦点。
[0007] 黄曲霉毒素Bi(AFBi)难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酬和氯仿等有机溶剂，耐高温， 分解温度为268°C，W上特点决定黄曲霉毒素的分离、降解难度大。解除黄曲霉毒素危害的 型式为分离去除和分解化学结构失去毒性。近年来人们采用的解毒方法分为物理方法、化 学方法和生物方法。物理法为水洗、矿物质吸附、射线福照等，此法劳动强度大，矿物质吸附 饱和度限制了对饲料的处理量，福照解毒不彻底；化学法均采用强酸、强碱和强氧化剂等化 学试剂降解毒素，其特点是降解毒素彻底，饲料营养成分有不同程度破坏，均有化学残留， 给家禽、家畜带来二次伤害（二次污染）；生物学法是近年来研究较多方法，也是人们最重 视的方法。大量研究结果表明，生物学法是最可靠最科学的解毒方法，其特点是条件温和， 副作用小，不产生二次污染，不破坏营养成分等，越来越受到人们的重视。食用真菌菌丝体 深层液体发酵产物多含有降解黄曲霉毒素的活性成分，也是人们研究较多的菌种。
[000引微生物发酵制剂降解黄曲霉毒素主要采用细菌和真菌，国外大量资料研究显示结 果为，真菌多但细菌报道较少。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供趟皮侧耳发酵液的制备方法及该发酵液在降解黄曲霉毒 素Bi中的应用。
[0010] 本发明的整体技术构思是：
[0011] 趟皮侧耳发酵液的制备方法，是将趟皮侧耳（Pleurotusostreatus)CICC14012接 种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌发酵培养基中进行通气发酵制成发酵液；
[0012] 发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
[001 引 ±豆淀粉 6.0 % -7.0 %，庶糖 1.8 % -2. 2 %，酵母膏 0. 18 % -0. 22 %，硫酸 锭 0. 29 % -0. 33 %，磯酸二氨钟 0. 25 % -0. 30 %，硫酸儀 0. 15 % -0. 18 %，维生素 Bi0. 0001 % -0. 0003 %，微量元素溶液 5. 0 % -6. 0 %，襲芦醇 430yL/1-470yL/1，吐温 80 0. 1% -0. 13%，余量为无菌水，pH= 4. 9-5. 3 ;
[0014]微量元素溶液由W下原料组成：
[0015] 氯化巧1500mg，硫酸亚铁150mg，硫酸锋lOOmg，硫酸铜150mg，硫酸铺lOOOmg，硫酸 钻200mg，硫酸侣钟20mg，棚酸lOmg，钢酸钢20mg，定容至1000血；
[0016] 通气发酵的工艺条件如下：
[0017]接种量为体积比=6-8 : 100,温度为26°C-28°C，通气量为1 : 0. 7-1. 2vvm，压 力为0. 03Mpa-0. 05Mpa，培养周期为不低于240小时。
[001引可W显而易见的是发酵终点的控制除时间因素外，应结合722可见光分光光度 计，采用考马斯亮藍法监测发酵液中蛋白质浓度，确定发酵终点。
[0019] 采用上述方法制备的趟皮侧耳发酵液在降解黄曲霉毒素Bi中的应用。
[0020] 本发明的具体技术构思还有：
[0021] 出于工业化生产的需要，优选的技术方案是，所述的趟皮侧耳菌种在接入无菌发 酵培养基前经过扩大培养。
[0022] 更为优选的技术方案是，所述的扩大培养包括斜面菌种的制备、平皿菌种制备、一 级种子的制备W及二级种子的制备。
[0023] 斜面菌种的制备采用马铃馨培养基，平皿菌种的制备采用葡萄糖培养基，温度为 25°C-27°C，培养周期为4-5天。
[0024] 一级种子的制备W及二级种子的制备中种子培养基采用如下质量百分含量的原 料组成：
[002引 ± 豆汁 18 % -21 %，葡萄糖 1. 8 % -2. 2 %，酵母膏 0. 25 % -0. 30 %，硫酸 锭 0. 29 % -0. 33 %，磯酸二氨钟 0. 25 % -0. 30 %，硫酸儀 0. 15 % -0. 18 %，维生素 Bi0. 0001% -0. 0003%，微量元素溶液 3. 5% -4. 5%，余量为无菌水，pH= 5. 0-5. 5 ;
[0026] 微量元素溶液由如下质量的原料组成：
[0027] 氯化巧1500mg，硫酸亚铁150mg，硫酸锋lOOmg，硫酸铜150mg，硫酸铺lOOOmg，硫酸 钻200mg，硫酸侣钟20mg，棚酸lOmg，钢酸钢20mg，定容至1000血。
[002引一级种子的制备采用如下工艺步骤：
[0029] 挑选生长旺盛、健壮的平皿菌种，在菌丝生长旺盛部位切成直径7mm-13mm圆片， 按每瓶3-5片接种量将其接种到装有一级种子培养基=角瓶中，在温度为26°C-28C条件 下振荡培养85-96小时制成一级种子；装量为1000ml的S角瓶装入160-200ml-级种子培 养基，W目测一级种子培养基中有一定量的菌丝体悬浮，W镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致 为一级种子培养终点。
[0030] 二级种子的制备采用如下工艺步骤：
[0031] 按照一级种子与二级种子培养基的体积比=9-11 : 100的比例，将一级种 子接入灭菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，