与母猪发情征状相关的分子遗传snp标记及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物分子育种技术领域，设及与母猪发情征状相关的分子遗传SNP标 记及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 在猪的育种程序中，很少有将母猪的发情征状作为一个育种指标。运导致了母猪 产仔数提高的同时其发情征状却越来越不明显，出现更多隐性发情，使得发情鉴定变得非 常困难，必须要采用试情公猪反复试情或其他技术手段才能准确地进行发情鉴定，猪场繁 殖效率大大下降。
[0003] 母猪的发情征状具有一定的遗传性。研究发现，国外商业猪种母猪发情征状不如 我国地方猪种母猪明显。发情征状在品种间的明显差异说明其存在一定的遗传性，因为不 同品种具有不同的遗传背景。Rydhmer等（1994)对740头约克夏母猪研究发现：初情期 日龄、发情前期时间、发情期持续时间、"静立反射"和外阴发情征状的遗传力分别为0.32、 0. 23、0. 16、0. 29和0. 24。研究还发现发情征状与窝产仔数之间的遗传相关非常弱，发情征 状可W单独作为一个遗传性状来进行选择。母猪初情期的发情征状与第一次断奶后的发情 征状存在正相关。
[0004] 在母猪的发情周期中，发情中期时母猪阴户红肿，并伴有"静立反射"现象，此时， 大约处于卵巢排卵前两天，雌激素巧strogen)的水平达到高峰值。研究表明母猪发情期血 清中雌激素的浓度与阴户肿胀、阴户颜色、阴道粘膜颜色、黏液稀稠度和静立反射5个发情 征状存在显著的相关性。
[0005] 雌激素水平受雌激素合成通路相关基因影响。卵巢雌激素的合成是在促黄体生成 激素（LH)和卵泡生成素（FSH)的作用下，由卵泡膜细胞和颗粒细胞共同完成。卵泡膜细 胞上有LH受体，LH与LH受体结合后，使卵泡膜细胞内的胆固醇转化为睾酬和雄締二酬，睾 酬和雄締二酬透过基底膜从卵泡膜细胞进入颗粒细胞内。颗粒细胞上有F甜受体，F甜与 FSH受体（FSHR)结合后激活颗粒细胞内的芳香化酶活性，将睾酬和雄締二酬分别转化为雌 二醇和雌酬。动物体内雌激素水平的高低取决于合成与代谢动态平衡的结果，其合成与代 谢过程需要许多生物酶的参与，如芳香化酶CYP19，17a -径化酶（CYP17A1)，17P -径基酱 体脱氨酶，酱体硫酸醋酶等。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一个与母猪发情征状及发情期血清雌激素浓度相关的分 子遗传SNP标记。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供用于检测该SNP检测方法。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供该SNP标记的用途。
[0009] 本发明的目的可通过W下技术方案实现：
[0010] 与母猪发情征状及发情期血清雌激素浓度相关的分子遗传SNP标记，所述SNP标 记位于猪14号染色体上的CYP17A1基因的核巧酸序列上，所述SNP标记位点rs80850169 为国际猪基因组10. 2版本参考序列猪14号染色体上g. 123778229核巧酸位点（即位于猪 细胞色素P450家族CYP17A1基因第5122bp碱基处），该位点的等位基因为C和T，有CC、 CT和TT =种基因型；所述的SNP标记与母猪发情期血清雌激素浓度和发情征状的表现强 度显著相关，带有TT基因型的母猪在发情周期中血清雌激素浓度和发情征状表现强度显 著高于CC基因型。
[0011] 一种基于本发明所述的SNP标记开发分子标记的方法，W含有本发明所述的SNP 标记的核巧酸序列为基础序列，设计引物对，长白猪X大白猪"杂种母猪基因组DNA为 模板进行PCR扩增，使本发明所述的SNP标记转化为分子标记。 阳01引其中，所述的引物对序列优选：上游引物：SEQ ID NO :2,下游引物：SEQ ID NO :3 ; 所述的分子标记序列优选如SEQ ID NO: 1所示，所述的SNP位点位于第316位，存在T/C多 态性。
[0013] 按照权利要求2或3所述的方法得到的分子标记。
[0014] 所述的分子标记序列优选如SEQ ID NO : 1所示，所述的SNP位点位于第316位，存 在T/C多态性。
[0015] 一种用于检测本发明所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO :2,下游 引物为：SEQ ID NO :3。
[0016] 一种检测本发明所述的SNP标记的方法，包含PCR扩增"长白猪X大白猪"杂种 母猪基因组中含有本发明所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点 的T/C多态性。
[0017] 所述的方法优选包括W下步骤：
[0018] (1)取"长白猪X大白猪"杂种母猪的耳组织样品并提取总DNA;
[0019] 似用已提取的"长白猪X大白猪"杂种母猪基因组DNA为模板，使用本发明所述 的引物进行PCR扩增；
[0020] 做将PCR扩增产物使用Msp I限制性内切酶进行酶化分析酶切结果，根据酶切 结果判断在SEQ ID NO :1第316位的T/C多态性。
[0021] 本发明所述的SNP标记、分子标记、引物在筛选发情期高血清雌激素浓度W及发 情症状强的"长白猪X大白猪"杂种母猪品系中的应用。
[0022] 一种筛选发情期高血清雌激素浓度W及发情症状强的"长白猪X大白猪"杂种母 猪品系的方法，包括检测"长白猪X大白猪"杂种母猪猪14号染色体上g. 123778229核巧 酸位点的基因型，选育该核巧酸位点的TT型个体作为种猪。 阳〇2引有益效果：
[0024] 本发明对100头"长白猪X大白猪"杂种母猪系统地分析了雌激素合成与代谢通 路相关基因的遗传多态性，对雌激素合成与代谢通路相关基因的50个SNP位点进行基因型 分析，结果发现：位于猪14号染色体上的细胞色素P450家族CYP17A1基因第5122bp碱基 处SNP位点与发情期母猪血清中雌激素浓度极显著相关。该分子标记在母猪发情鉴定中的 应用，为母猪发情鉴定选育提供一个新的分子遗传标记。
【附图说明】 阳0巧]图1为Msp I限制性内切酶的酶切位点。
[0026] 图2为使用本发明的引物扩增CYP17A1基因产物的电泳图。
[0027] 图3为使用Msp I限制性内切酶酶切后产物的电泳图。
【具体实施方式】
[0028] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 阳〇29] 实施例1
[0030] 试验样品的采集
[0031] 试验猪群来自中国常州金坛市的江苏永康农牧有限公司，采集的100头"长白 猪X大白猪"杂种母猪的耳组织，放入含有75%酒精中2mL离屯、管中，-20°c保存。采集每 头母猪前腔静脉血液5血，在室溫下静置化，300化/min离屯、5min，取上层血清于1. 5血离 屯、管中，-20°C保存。 阳0巧实施例2 阳03引一、100头母猪基因组DNA提取
[0034] 本发明所使用猪群体的DNA样品全部采用传统酪氯仿法提取，所需试剂包括：
[0035] 裂解液实验室配备
[0036] 蛋白酶K (德国MERCK生物科技有限公司）
[0037] Tris饱和酪（北京索莱宝生物科技有限公司）
[0038] Tris饱和酪：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)(北京索莱宝生物科技有限公司）
[0039] 氯仿（江苏永华精细化学品有限公司）
[0040] 无水乙醇（广东光华科技股份有限公司）
[0041] 3M乙酸钢（北京索莱宝生物科技有限公司）
[0042] 具体步骤如下所述：
[0043] 取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2ml离屯、管中； 阳044] 加入裂解液（自己配备）800 y L，及蛋白酶K 30 y L (40mg/ml);
[0045] 样品置于55°C恒溫箱中解育过夜，至管中无组织块为止；
[0046] 加入 Tris 饱和酪 800 y L 轻微混匀 lOmin，4°C 12000r/min 离屯、12min ;<