一种利用微卫星标记鉴定混养松浦镜鲤家系的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种利用微卫星标记鉴定鲤鱼家系的方法。
【背景技术】
[0002] 松浦镜鲤是黑龙江水产研究所在德国镜鲤选育系（F4)的基础上培育出的鲤新品 种，于2011年育成并经水产原良种委员会登记（2011年以前报到的"松浦镜鲤"如未标明 第几代则均非本松浦镜鲤新品种）。该鱼的生长速度、出肉率均远高于同种其它鲤鱼，且鳞 少易加工，目前已推广到全国20多个省市养殖，带来显著的经济和社会效益。然而，另一方 面，松浦镜鲤和其他鲤鱼一样，一些重要性状如抗病力、越冬体重损失率、胴体品质等遗传 力较低，采用群体选育很难获得理想的遗传进展。大量养殖动物的育种实践证明，家系选育 是行之有效的育种方法，特别是针对一些低遗传力的数量性状。因此，开展家系选育是未来 进一步选育松浦镜鲤优质品系的必由之路。家系选择以家系为单位，以家系表型度量均值 为依据。鱼类特殊的繁殖方式令家系选育比其它选育方法更具优势。鱼类早期个体过小， 难以利用物理标记进行家系区分；因此，目前主要采用将不同家系来源的初孵仔鱼分别放 入不同的网箱中在同一水体中养至可标记大小，然后打入物理标记物再同塘混养。但这种 方法的问题在于初孵仔鱼很小但生长很快，网箱的透水性、投喂一致性均不易控制，易形成 不同网箱生态环境的差异，使选育受到环境因素的影响而不准确。
[0003] 为了剔除环境对不同家系个体目标性状的影响，最好将不同家系来源的受精卵混 合，待孵化后始终置于同一环境进行养殖，待鱼体长到一定大小，打入电子标记并记录，同 时采集鳍条进行DNA检测，利用多态性分子标记进行家系区分。这种方法可保证不同家系 间受环境影响的程度最小。然而，为使外形和目标性状稳定表现，养殖鱼类在新品种育成过 程中须经历一定程度的近交及多个世代的较高选择压的选择，很多多态性丰富的位点在此 过程中变为纯合，等位基因在不同程度上发生丢失；而且，选择和漂变会使一个微卫星标记 的等位基因在同一种鱼类的不同品种或品系间产生很大的差异。所以，鱼类的微卫星标记 无法通用，必须针对品种或品系选择特定的DNA标记进行亲缘关系鉴别。研究结果也证实 了这一点，许多在德国镜鲤选育系（F4)或其它鲤品种中具有丰富多态性的标记位点在松 浦镜鲤中已经纯合或多态性较低，不宜于在松浦镜鲤家系鉴定中应用。
【发明内容】
[0004] 为了选育优良松浦镜鲤家系，本发明提供了一种利用微卫星标记鉴定混养松浦镜 鲤家系的方法。
[0005] 鉴定混养松浦镜鲤家系按以下步骤进行：
[0006] -、提取松浦镜鲤各家系亲本及混养子代个体基因组DNA，并以亲本和子代的DNA 为模板，以微卫星标记引物进行多重PCR反应；
[0007] 二、将步骤一PCR产物上样10%聚丙烯酰胺凝胶，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染 显色，电泳图谱利用Gel-proanalyzer4. 5软件分析，结合PCR产物长度和四碱基重复单元 确认基因片段大小并判定基因型；
[0008] 三、根据步骤二的分析结果建立混养松浦镜鲤亲本及子代的基因型数据文件；
[0009] 四、利用CerVus3. 0软件计算各位点等位基因频率，获得各位点的相关遗传参数 及整合后的排除率；
[0010] 五、利用Cervus3. 0软件提供的父母对分析程序进行计算，并根据计算出的候选 亲本的LOD值确定子代个体家系来源。
[0011] 本发明方法利用CerVus3. 0软件对混养子代基因型数据进行分析，计算等位基因 频率和遗传参数，9个微卫星标记位点共检测出53个等位基因，平均等位基因数为5. 889 个，所有位点均具有高度多态性（PIC>0. 5)，平均多态信息含量为0.690。本发明方法在 混养子代基因型与可能父本及母本基因型已知的情况下，排除率为0.99046 ;在已知子代 基因型和一个确定亲本的情况下，子代与另一亲本关系的排除率为0.99948;在已知子 代基因型和可能亲本对基因型的情况下，排除率可达0. 99997,随机个体的一致性概率为 4. 6X10 9〇
[0012] 本发明方法利用微卫星标记技术可以准确的、高效的确定混养松浦镜鲤子代的家 系来源；为实现松浦镜鲤混养，避免环境因素对不同家系个体目标性状的影响奠定了技术 基础；进而更加有效地、周期更短的选育出优良松浦镜鲤家系。
【附图说明】
[0013] 图1是实施例1步骤二聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色效果图。
【具体实施方式】
[0014] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0015] 一：本实施方式鉴定混养松浦镜鲤家系按以下步骤进行：
[0016] -、提取松浦镜鲤各家系亲本及混养子代个体基因组DNA，并以亲本和子代的DNA 为模板，以微卫星标记引物进行多重PCR反应；
[0017] 二、将步骤一PCR产物上样10%聚丙烯酰胺凝胶，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染 显色，电泳图谱利用Gel-proanalyzer4. 5软件分析，结合PCR产物长度和四碱基重复单元 确认基因片段大小并判定基因型；
[0018] 三、根据步骤二的分析结果建立混养松浦镜鲤亲本及子代的基因型数据文件；
[0019] 四、利用CerVus3. 0软件计算各位点等位基因频率，获得各位点的相关遗传参数 及整合后的排除率；
[0020] 五、利用Cervus3. 0软件提供的父母对分析程序进行计算，并根据计算出的候选 亲本的LOD值确定子代个体家系来源。
[0021] 步骤一中微卫星标记引物为9对，微卫星标记引物信息如表1所示。
[0022]表 1
【具体实施方式】 [0024] 二：本实施方式与一的不同点是：步骤一中9对微卫 星标记引物分4组进行多重PCR反应；第一组PCR反应由微卫星标记1、微卫星标记2和微 卫星标记3的引物对进行；第二组PCR反应由微卫星标记4和微卫星标记5的引物对进行； 第三组PCR反应由微卫星标记6和微卫星标记7的引物对进行；第四组PCR反应由微卫星 标记8和微卫星标记9的引物对进行。其它步骤及参数与实施方式一相同。
[0025] 实施例1
[0026] 2013年从中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰实验中心的松浦镜鲤核心 群中挑选健康的14个雄性和37尾雌性亲鱼，以不平衡的巢氏交配的方法配组，按每尾雄鱼 与2~3尾雌鱼交配，通过人工授精建立37个全同胞家系。配组时收集亲鱼鳍条样本，同 时记录性别，将带有不同交配组合编号的受精卵单独孵化。子代松浦镜鲤个体始终同池、同 条件养殖，在生长至第60天时，对所有松浦镜鲤子代个体（共1318尾）电子标记、记录，并 采集鳍条用于亲缘关系鉴定。
[0027] -、提取松浦镜鲤亲本及混养子代个体基因组DNA:
[0028] (1)取松浦镜鲤亲本和子代的鳍条组织（每尾约60mg)，剪碎后置于I. 5mLEP管 内，加入600yL组织提取液和10yL蛋白酶K，在56°C150r/min的摇床上消化过夜；
[0029] (2)加入600yLTris饱和酚上下颠倒10分钟，然后12000r/min离心10分钟，取 上层水相，加入等体积酚-氯仿-异戊醇（24:23:1)，混合10分钟；
[0030] (4) 12000r/min离心10分钟，取上层水相，加入等体积氯仿-异戊醇（23:1)，混合 10分钟；
[0031] (5) 12000r/min离心10分钟，取上层水相，加入2倍体积的无水冰乙醇（_20°C保 存），水平摇动，直到出现白色絮状物；
[0032] (6) 10000r/min离心10分钟，管底可见白色DNA沉淀，用牙签将沉淀挑入装有 500yL体积浓度70%冰乙醇的I. 5mLEP管，8000r/min离心5分钟，倒掉乙醇，自然干燥；
[0033] (7)加适量的TE缓冲液，置于55°C的水浴锅中溶解DNA4h，将基因组DNA置-20°C 保存；
[0034] 以亲本和子代的DNA为模板，以微卫星标记引物进行多重PCR反应；其中微 卫星标记引物为9对；微卫星标记1上游引物碱基序列为CGACGATCAAGTTAATGTGTCC， 微卫星标记1下游引物碱基序列为GACAGCCTATTCCCAGTCCA，标记位点为HLJ1115 ;微 卫星标记2上游引物碱基序列为AAAATCTCAACAACTACAGGCAAA，微卫星标记2下游引 物碱基序列为CACTGGTCATCGCTTAGACG，标记位点为HLJ3526 ;微卫星标记3上游引 物碱基序列为GAGTCTACAATAAAGAAATGGAAAAGTC，微卫星标记3下游引物碱基序列 为AGTGCCTTCAGCGGTTCATA，标记位点为HLJ3656 ;微卫星标记4上游引物碱基序列为 CAGTGCCCAAAAACAATGC，微卫星标记 4