检测Echovirus30病毒的特异性引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种病毒性脑炎相关病毒Echovirus30的特异性检测引物、探针及其荧光定量PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人类埃可病毒30型（Echovirus30,ECH030)属于B型肠道病毒，是引起儿童和成 人无菌性脑膜炎的主要病原体之一。在儿童病毒性脑炎病例中，由ECH030病毒引起的病例 占80~93%。该病毒是一种无胞膜病毒，能在恶劣的环境条件（如高盐、高pH值和37°C) 下稳定存活。人在感染人类肠道病毒后的几周内仍能从呼吸道和肠道中排出病毒，从而引 起病毒传播、感染甚至暴发流行。
[0003]近年来在我国台湾、浙江、福建和河南等地多次报道由ECH030引起病毒性脑炎的 暴发或流行。2012年5月初，广东省罗定市报告一起以发热、头痛、呕吐为主要临床症状的 脑炎流行。此次疫情共报道246例脑炎病例，其中ECH030占所有确诊分型病例的60 %。自 此，ECH030 -直是广东省重点监测传染病之一，其尽快确诊可帮助及早发现疫情，尽快采取 措施，在最小范围控制疫情，从而把损失减到最少。
[0004]对人肠道病毒感染进行检测与分类的试验方法目前在现阶段主要有三大类：一是 传统的病毒分离与血清中和试验；二是人肠道病毒的血清抗体检测；三是分子生物学分型 方法。
[0005]传统的病毒分离与血清中和试验定型虽然是人肠道病毒检测的金标准，但由于检 测时间长、中和试验繁琐等局限性，作为早期快速检测方法有很大的局限性。用于血清学 检测的酶联免疫吸附试验（ELISA)相对而言具有方法简便、快速等优点，但由于人肠道病 毒型别众多，ELISA-IgM试剂盒多采用混合抗原，特异性较低，不能准确检测出某一血清型 人肠道病毒感染，所以同样具有局限性。2006年，Nix等通过对人肠道病毒遗传性分析，提 出根据VPl区全长或部分序列同源性大小进行肠道病毒型别判断的标准。针对ECH030,其 分子分型可通过利用肠道病毒的通用引物，采用巢式聚合酶链反应（PCR)扩增出目的片段 后，再经过测序及序列比对进行判定。但该方法对脑炎病例中ECH030的检测技术要求较 高，在基层医院及市、县级疾控中心难于普及。另外，该巢式PCR方法灵敏度较低，检测周期 较长导致首发病人往往不能及时确认病原，而没有及时采取有效措施，从而引起疫情蔓延。 每宗疫情在其发现时已陷入被动局面，进而花费巨大的人力物力去控制。
[0006]因此，开发出灵敏、简便、快速、经济、适宜于基层单位推广使用的ECH030诊断试 剂成为急需解决的难题。
[0007]Real-TimePCR技术，又称实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基 团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分 析或通过Ct值对模板进行相对定量。与常规PCR相比，实时定量PCR无需取出PCR产物进 行分离，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。作为一个极有 效的实验方法，实时定量PCR已被广泛用于人类传染病的诊断。
[0008] 由于ECH030病毒于近几年才在我国有暴发流行，目前在NCBI数据库中公开的 在我国流行的ECH030毒株的序列还较少，因此根据少数序列较难设计出特异的及灵敏的 ECH030病毒检测试剂盒。目前，国内尚无检测ECH030病毒的实时定量荧光PCR试剂盒，对 ECH030病毒的检测仍然依靠巢式PCR的方法和细胞培养的方法，具有检测技术要求高，检 测周期长，灵敏度差等缺点。
【发明内容】
[0009] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种检测Ech〇VirUS30病 毒的特异性引物、探针及荧光定量PCR检测试剂盒，解决了现有技术的对检测技术要求高， 检测周期长，灵敏度差的缺点。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0011] 一种检测Echovirus30病毒的特异性引物，所述特异性引物具有如SEQIDN0:2 和SEQIDNO:3所示的碱基组成。
[0012] 一种检测Ech〇Virus30病毒的探针，所述探针具有如SEQIDN0:4所示的碱基组 成。
[0013] 在其中一个实施例中，所述探针的5'端带荧光基团FAM，3'端带淬灭基团TAMRA。
[0014] -种检测Echovirus30病毒的试剂盒，包括有：上述的检测Echovirus30病毒的特 异性引物、和上述的检测Echovirus30病毒的探针。
[0015] 在其中一个实施例中，所述检测Ech〇VirUS30病毒的试剂盒还包括反应缓冲液和 酶反应液，所述反应缓冲液包括dNTPs、MgCljP稳定剂，所述酶反应液包括反转录酶、热启 动DNA聚合酶和RNase抑制剂。
[0016] 本发明通过对2012年广东暴发流行的Echovirus30以及2008-2012年在广 州环境污水中检测的Echovirus30，共26个毒株进行测序，同时结合Genbank中所有 Echovirus30基因序列，通过序列比对，确定相对保守的片段作为检测祀标，设计特异的检 测引物对和探针，成功研制了Ech〇Virus30病毒实时定量荧光PCR检测试剂盒。与现有技 术相比，本发明具有以下有益效果：
[0017] 1、本发明检测Ech〇VirUS30病毒采用特异性的引物和探针以及优化的检测体系， 试剂盒灵敏度与特异性均能达到100%，远远高于国内目前常规方法即巢式PCR与测序相 结合的方法（其灵敏度只有46. 2% );
[0018] 2、本发明的检测Echovirus30病毒的荧光定量PCR检测试剂盒经BioRad数字PCR 仪绝对定量，该试剂盒可以检测到含量低至27. 7copy八d的样品；
[0019] 3、本发明的检测Echovirus30病毒的方法无需对PCR产物进行测序，大大缩短了 现有方法的检测周期；
[0020] 4、本发明的Ech〇Virus30病毒的实时定量荧光PCR检测试剂盒通过检测脑脊液、 奠便等标本中Echovirus30病毒核酸，可对感染Echovirus30病毒的病人进行早期诊断，填 补了国内针对Echovirus30病毒的试剂盒的空白。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明试验例1中阳性样本的检测结果，其中A为26份细胞分离鉴定为阳 性标本的巢式PCR第一轮凝胶电泳图；B为26份细胞分离鉴定为阳性标本的巢式PCR第二 轮凝胶电泳图；C为26份细胞分离鉴定为阳性标本的荧光定量PCR扩增曲线图；
[0022] 图2为本发明试验例3中数字PCR仪的绝对定量结果。
【具体实施方式】
[0023] 下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而 不是对本发明的保护范围的进一步限定。
[0024] 以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产 品。
[0025] 实施例1 一种Echovirus30病毒的实时定量荧光PCR检测试剂盒
[0026] 本实施例所述的检测试剂盒的制备包括以下步骤：
[0027]1、确宙检测的靶标及特异引物及探针
[0028] 通过对广东省菌毒种库保藏的共26株ECH030病毒进行测序，同时结合GenBank 中的共29条ECH030病毒序列，通过目的基因VPl的序列比对确定相对保守的片段SEQID NO: 1作为检测的靶序列；
[0029] 应用Bioedit以及PrimerPremier5. 0等软件对其进行生物信息学分析，针对SEQ IDNO: 1 序列，设计qPCR引物对SEQIDNO: 2 和SEQIDNO: 3 和Taqman探针SEQIDNO: 4。 引物和Taqman探针送交生物公司合成。
[0030] 具体序列如下：
[0031] 检测的靶序列SEQIDN0:1 :KM034804(7-132nt)
[0032] 5'-cctgaaagtgcaatcaacagg