水泡性口炎病毒和/或猪水泡病病毒的基因芯片以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测水泡性口炎病毒和/或猪水泡病病毒的基因芯片以及检测 方法。
【背景技术】
[0002] 水泡性口炎（Vesicularstomatitis,VS)和猪水泡病（Swinevesicular disease,SVD)分别是由水泡性口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus,VSV)和猪水泡病 病毒（Swinevesiculardiseasevirus,SVDV)引起的哺乳动物的急性、高度接触性传染 病，这两种类型的病毒都可以感染猪，发病率极高，并能够形成大范围的流行，能引起严重 的公共卫生问题，均被世界动物卫生组织（OIE)列为法定报告动物疫病。这两种疾病均以 猪舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要症状，因此在临床症状上无法对 这三两疾病进行区分，必须通过病原学进行鉴别诊断。
[0003]目前，对这两种疾病的诊断多采用分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长， 也有PCR技术的鉴别方法，但还没有建立操作性强且能同时鉴别两种病毒的方法。因此，有 必要建立能同时进行两种疫病快速检测的方法。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检测水泡性口 炎病毒和猪水泡病病毒的基因芯片和试剂盒。
[0005] 基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、CDNA、gen〇miCDNA、多肽、 抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的 生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本发明检测水泡性口炎病毒和/或猪水泡病病毒的基因芯片，它包括固相载体以 及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQIDNO:1~2所示基因片段，用于检测水泡 性口炎病毒和/或猪水泡病病毒。
[0007] 其中，它还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQIDNO:7~8所示。
[0008] 本发明检测水泡性口炎病毒和/或猪水泡病病毒的试剂盒，它包括前述的基因芯 片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQIDNO:3~4、SEQIDNO:5~6所示引物对，用 于扩增水泡性口炎病毒和/或猪水泡病病毒。
[0009] 其中，所述引物对中，上游引物与下游引物的摩尔比为1:1。
[0010] 其中，所述SEQIDNO:3、5所示上游引物标记有荧光染料。
[0011] 本发明还提供了SEQIDNO:1~2所示基因片段在制备检测水泡性口炎病毒和 /或猪水泡病病毒的基因芯片的用途。
[0012] 其中，所述基因芯片还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQIDNO:7~8所示。
[0013] 本发明还提供了SEQIDNO:3~4、SEQIDNO:5~6所示引物对以及SEQIDNO: 1~2所示基因片段在制备检测水泡性口炎病毒和/或猪水泡病病毒的试剂盒中的用途； 其中，引物对为扩增试剂，SEQIDNO:1~2所示基因片段为检测探针。
[0014] 本发明基因芯片和试剂盒可以同时检测、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒，特异 性强，灵敏度高耗时短，检测快速，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况临床应用前景良好。
[0015] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0016] 图1芯片矩阵设计
[0017] 图2水化温度优化
[0018]图3封闭液配比优化。1:0? 5%BH4Na, 25%Ethanol;2: 0? 25%BH4Na, 25% Ethanol;3:0%BH4Na, 25%Ethanol;4:0. 5%BH4Na, 15%Ethanol;5:0. 25%BH4Na, 15% Ethanol；: 0 %BH4Na, 15%EthanoI；7:0. 5 %BH4Na, 0%Ethanol；8:0. 25 %BH4Na, 0% Ethanol；9:0%BH4Na,0%Ethanol.
[0019] 图4探针筛选矩阵设计
[0020] 图5水泡性口炎探针筛选
[0021] 图6猪水泡病探针筛选
[0022] 图 7 水泡性口炎芯片灵敏度。A: 10-5 ;B:10-6 ;C: 10-7 ;D:10-8.
[0023] 图 8 猪水泡病芯片灵敏度。A: 10-4 ;B: 10-5 ;C: 10-6 ;D: 10-7.
[0024] 图9水泡性口炎引物的特异性实验。1:VSV;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A;4:FMDV-AsiaI; 5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV； 10!Negativecontrol
[0025] 图10猪水泡病引物的特异性实验。1:SVDV;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A;4:FMDV-AsiaI; 5:VSV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV； 10!Negativecontrol
[0026] 图11水泡性口炎不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BaiO?l醛基基 片；B:北京博奥生物有限公司晶芯_醛基基片
[0027] 图12猪水泡病不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BdO?醛基基 片；B:北京博奥生物有限公司晶芯》醛基基片
【具体实施方式】
[0028] 一、实验材料和仪器
[0029] I. 1材料试剂：
[0030]
[0033] I. 3实验试剂的配制
[0034] 引物稀释：根据合成单，将合成的引物干粉加入适量灭菌超纯水，制成100yM的 引物贮存液，使用时按照1 :4(引物贮存液：灭菌超纯水）的体积比将其稀释成20yM的引 物使用液；
[0035] 10g/L琼脂糖凝胶：称取Ig琼脂糖凝胶，加入IOOmLlXTAE电泳缓冲液中，微波炉 加热3min，溶解完全后加入lOmg/mL的EB5yL，震荡混勾，倒入胶槽内，待凝固后点样；
[0036] 营养肉汤培养基：按照产品说明书，称取所需质量的培养基干粉于三角锥瓶内，加 入相应比例的去离子水，121°C灭菌20min，备用；
[0037] 营养琼脂培养基：按照产品说明书，称取所需质量的培养基干粉于三角锥瓶内，加 入相应比例的去离子水，121 °C灭菌20min，备用。
[0038] 20XSSC:称取NaCl，175. 2g，柠檬酸三钠，21120，100. 5g，溶解于少量mini-Q超纯 水中，用5MHCl调pH至7. 0,最后用Mini-Q双蒸水定容到IL;
[0039] 10XPBS:按mol数/IL含 1370mMNaCl，270mMKC1，IOlmMNa2HP04,18mMKH2P04; 按g数/IL含NaCl，80g，KCl，2g，Na2HP04 ? 12H20, 35. 8g，KH2P04, 2. 7g，溶于 800mL蒸馏水 中，用HCl调节溶液的pH值至7. 4,加蒸馏水定容至IL;
[0040] 10%SDS:称取SDS100g，溶于 900mLMini-Q水中。
[0041] 杂交后洗液I:SSC终浓度为2X，SDS终浓度为0.2%，若10%SDS产生白色絮状 沉淀，请置于42°C水浴中溶解混匀后配制洗液。
[0042] 杂交后洗液II:SSC终浓度为0?2X。
[0043] 实施例1本发明检测方法
[0044] 1、材料和仪器
[0045] 同前述实验材料和仪器。
[0046] 2、实验方法
[0047] 2. IPCR引物、检测探针的设计与合成
[0048] 2.I. 1引物设计：
[0049] 根据NCBI公布的VSV序列以及SVDV序列，在充分比较同源性的基础上，选取保守 区用软件PrimerPrimer5. 0软件设计引物并进行BLAST序列比对初步验证引物特异性。 本研究所用引物详见表1，每对引物的上游引的5'端均连接有一个Cy3荧光基团。所有引 物由生工生物工程（上海）公司合成。
[0050] 表1引物序列与目的扩增产物大小
[0051]
[0052] 2. 1. 2探针设计：
[0053] 根据2.I. 1所设计引物扩增区段，使用PrimerPrimer5. 0设计软件设计VSV以 及SVDV的特异性探针，每种目的片段设计多条探针，以备筛选。芯片探针序列及修饰方 法：每条探针的5'端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。前者的作用是使探 针在固相支持物一一玻璃片上充分伸展开，后者的作用是与醛基修饰的玻璃片进行缩合反 应，以固定在玻片上。使用一段随机序列作为位置质控（Positioncontrol,PC)，其5'端 连接有一个氨基，3'端连接一个Cy3荧光基团；使用一段随机序列作为杂交质控（Hybrid control，HC)其5'端连接有一个Cy3荧光基团，并使用它的互补序列作为杂交质控探针 (Hybridcontrol-probe,HC-p)其5'端同样通过15个胸腺啼啶核苷酸连接有一个氨基。 检测探针序列具体如表2,质控序列如表3。
[0054] 表2检测探针序列
[0055]
[0056] 表3质控序列
[0057]
[0058] PC(PositionControl位置质控）、HC(Hybridcontrol杂交质控）、HC_p(HC_p本 身不发光，只有当HC与HC-p结合后该位点才会发光）（HC-p(Hybridcontrol-probe杂交 质控探针）
[0059] 2. 2标准质粒的构建
[0060] 病毒基因组RNA的提取及反转录
[0061] 按照宝生物（大连）有限公司的病毒RNA/DNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA模 板。
[0062] 病毒目的基因的克隆、测序分析
[0063] ①以反转录的病毒cDNA为模板，分别使用特异性引物进行PCR扩增。
[0064] PCR体系
[0065]
[0066] ②根据胶回收试剂盒说明书，胶回收FMDV-〇/A/AsiaI、VSV及SVDV扩增的PCR产 物，40yLElutionBuffer溶解。
[0067] ③根据pMD19-T载体连接试剂盒说明书，按照如下体系把胶回收的DNA片段连接 于pMD19-T载体上。
[0068] 连接体系：
[0069]
[0070] ④将连接产物转化入dH5a感受态细胞中，1)冰上融化感受态细胞；2)加入连接 后的质粒，冰上放置40min，42°C水浴90s，置于冰上，备用；3)加800yL无Amp的营养肉汤 培养基，37°C摇床震荡培养40min~60min;4)培养液在5000rpm离心3min，弃上清800yL， 混勾，取50yL涂含Amp(50yg/mL)的营养琼脂平板，37°C恒温箱倒置培养过夜。
[0071] ⑤次日，挑取转化的dH5a-pMD19T-VSV&SVDV单菌落，接入含Amp(50yg/mL)的营 养肉汤培养基的试管中，37°C，170rpm震荡培养过夜。
[0072] ⑥次日，取3mL经上述培养的菌液提取质粒，操作步骤见质粒提取试剂盒说明书。 提取质粒DNA用80yLElutionBuffer洗脱，1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：100V， 25min，上样 3yL。
[0073] ⑦提取质粒利用如前所述的体系、条件进行鉴定，模板体积为IyL，PCR产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：1〇(^，251^