无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物信息学技术领域，具体地说，涉及一种无参考基因组物种简化甲 基化测序文库的构建方法。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是重要的表观遗传学修饰，在细胞发育和分化、调控基因表达、X染色 体失活、基因沉默、疾病的发生等方面扮演着重要的角色，是目前新的研究热点之一。基于 二代测序技术发展起来的DNA甲基化检测技术可以提供大量的高通量、全基因组DNA甲基 化数据，极大地推动了表观遗传学研究的发展。重亚硫酸盐转换结合二代测序技术是目前 最精准的DNA甲基化检测方法，能够检测单碱基水平的甲基化状态，被称为DNA甲基化检 测的"金标准"。对基因组中未发生甲基化的胞嘧啶进行重亚硫酸盐处理，将其转换成U， 经PCR扩增后变成T，重亚硫酸盐转换对甲基化的胞嘧啶不起作用；通过结合二代测序，即 可绘制出单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。目前常用的重亚硫酸盐转化结合二代 测序技术的DNA甲基化检测技术有全基因组甲基化测序（BisylfiteSequencing，BS- seq)和简化代表性重亚硫酸盐测序（ReducedRepresentationBisulfiteSequencing， RRBS)。由于要确定甲基化的胞嘧啶的位点必须将重亚硫酸盐转化后的序列与参考基因组 进行比较，因此，这两种技术目前只能用于人、小鼠、大鼠等有高质量参考基因组序列的物 种，同时还存在着BS-seq建库成本高、RRBS所需限制性内切酶MspI酶切效率低等问题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案流程图见图1。
[0005] 具体地，本发明提供的无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法，包 括以下步骤：
[0006] (1)将ADNA加入待测样品的基因组DNA中；用限制性内切酶对待测样品的基因 组DNA酶切，获得5'末端具有磷酸化修饰的平末端DNA片段；添加碱基A，获得具有3'粘 性末端A的DNA片段；
[0007] (2)将步骤⑴获得的具有5'磷酸化和3'粘性末端A的DNA片段分别与含有不 同条形码序列的甲基化接头相连，获得可以区分样品来源的连接产物；
[0008] (3)纯化含有不同条形码的连接产物；将连接产物分为两份，一份作为对照组直 接进行PCR扩增，另一份作为处理组经过重亚硫酸盐转化后再进行PCR扩增，获得两组含有 相同条形码、仅在无甲基化的胞嘧啶位点不同的扩增产物序列；分别纯化两组PCR扩增产 物，定量后混合每组的PCR扩增产物；将两组混合后的PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶分 离纯化，选择相同的特定长度片段序列，切胶回收；
[0009] (4)特定长度片段的两组产物分别低循环PCR扩增，对目的片段范围内的序列进 行富集；两组低循环扩增产物分别进行琼脂糖凝胶分离纯化，纯化产物构成简化甲基化测 序文库。
[0010] 上述方法中，步骤（1)所述待测样品可以来自相同或不同的物种，样品数目彡1。
[0011] 其中，步骤（1)按照质量比1:1000将Iamda噬菌体基因组DNAUDNA)加入待测 样品的基因组DNA中。ADNA为本领域已知的用于评估重亚硫酸盐转化效率的商品化DNA。
[0012] 本发明方法中，步骤（1)所述限制性内切酶是甲基化不敏感型限制性内切酶。甲 基化不敏感型限制性内切酶酶切不完全率低，保证样品间酶切片段的一致性。本发明采用 的限制性内切酶是一种平末端限制性内切酶，或多种平末端限制性内切酶的组合，其酶切 产生的限制性片段是具有5'末端磷酸化修饰的平末端DNA片段。实施例中采用的限制性 内切酶是平末端限制性内切酶HaeIII。
[0013] 本发明方法中，步骤（2)所述的含有不同条形码序列的甲基化接头是指接头序列 中的胞嘧啶经过甲基化修饰且含有条形码序列。该含有不同条形码序列的甲基化接头可以 通过商业途径购买得到。
[0014] 进一步地，步骤（2)的具有5'磷酸化和3'粘性末端A的DNA片段分别与含有不 同条形码序列的甲基化接头的连接方法为混合体系置于20°C恒温金属浴孵育30min，65°C 失活20min。本领域技术人员应当理解，连接反应的温度和时间根据所采用的连接酶来确 定，并不局限于本申请所列的连接酶和连接的温度和时间等条件参数。
[0015] 本发明方法中，步骤（3)的PCR扩增所采用的引物与步骤（4)的低循环PCR扩增 所采用的引物相同，均为根据步骤（2)的甲基化接头的序列设计得到。
[0016] 进一步地，本发明实施例中，步骤（3)和步骤（4)PCR扩增所采用的引物序列如SEQ IDNO. 1-2 所示。
[0017] 本发明方法中，步骤（3)所述的定量后混合每组的PCR扩增产物是根据测序深度 的要求按照设定的质量比例将每组的PCR扩增产物进行混合；当待测样品数为1时，则无需 混合。本领域技术人员应当理解，对于不同的测序深度的要求，可以按照本领域公知的设计 原则，选择特定的质量比例将处理组和对照组中多个样品的PCR产物进行混合。
[0018] 本发明方法中，步骤（4)所述的低循环PCR是指循环数彡8的PCR。
[0019] 本发明的上述方法构建得到的高通量简化甲基化测序文库也属于本发明的保护 范围。
[0020] 本发明提供了上述方法构建得到的高通量简化甲基化测序文库在高通量无参考 基因组样品的甲基化状态研究中的应用
[0021] 本发明提供的高通量简化甲基化测序文库在后续应用时，通过比较处理组与对照 组序列中均有的胞嘧啶位点，确定样品中的甲基化位点，分析这些位点及其周围区域的序 列可以获得与遗传进化、生长发育相关的重要调控信息，为无参考基因组物种的表观遗传 学提供研究基础。
[0022] 本发明具有下列优点及有益效果：（1)本发明采用了实验条件尽量一致的对照组 和处理组平行操作，可以解决无参考基因组物种DNA甲基化研究的瓶颈；（2)使用了平末端 限制性内切酶，该方法不需要片段随机打断和末端修饰，高度简化了文库准备步骤；（3)使 用了酶切不完全率低的甲基化不敏感限制性内切酶和相同的切胶范围，保证了样品间所获 得的测序片段的一致性；（4)对照组和重亚硫酸盐处理组中的对应样品使用了含有相同条 形码序列的甲基化接头，且选择了相同的切胶范围，所获得的测序序列仅在无甲基化的胞 嘧啶位点不同，保证了两组文库序列对应关系的一致性。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明构建无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的流程图。
[0024] 图2为本发明实施例IPCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图中PCK代表PCR反应阴性对 照，1-9依次对应实施例1中的9个样品，J02代表酶切连接反应的阳性对照，ECK代表酶切 连接反应的阴性对照，所用Marker为TaKaRaIOObpDNALadder。
[0025] 图3为本发明实施例IPCR纯化产物琼脂糖凝胶电泳图。；图中PCK代表PCR反应 阴性对照，1-9依次对应实施例1中的9个样品，J02代表酶切连接反应的阳性对照，ECK代 表酶切连接反应的阴性对照，所用Marker为TaKaRaIOObpDNALadder。
[0026] 图4为本发明实施例1混合PCR纯化产物切胶前电泳图；所用Marker为NEB50bp DNALadder。
[0027] 图5为本发明实施例1混合PCR纯化产物切胶后电泳图；所用Marker为NEB50bp DNALadder。
[0028] 图6为本发明实施例1低循环PCR产物切胶前电泳图；图中1、2分别代表对照组 和处理组。
[0029] 图7为本发明实施例1低循环PCR产物切胶后电泳图；图中1、2分别代表对照组 和处理组。
[0030] 图8为本发明实施例1对照组文库质量控制检测图。
[0031] 图9为本发明实施例1处理组文库质量控制检测图。
[0032] 图10为本发明实施例1对照组文库测序产生的reads碱基质量得分（Quality score)图。
[0033] 图11为本发明实施例1处理组文库测序产生的reads碱基质量得分（Quality score)图。
[0034] 图12为本发明实施例1方法构建的高通量简化甲基化测序文库用于长苞冷杉甲 基化水平研究所构建的进化树图。
【具体实施方式】
[0035] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0036] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0037] 实施例1无参考基因组高通量简化甲基化测序文库构建及其应用于长苞冷杉的 表观遗传学进化分析
[0038] 本实施例选择长苞冷杉（Abiesge〇rgei)9个个体样品为实验材料，无参考基因组 高通量简化甲基化测序文库构建包括如下步骤：
[0039] 1、长荀冷杉基因组DNA被稀释至IOOng/yL(Nanodrop定量）；
[0040] 2、基因组DNA片段化利用平末端限制性内切酶HaeIII对第一步稀释的基因组DNA 进行酶切，酶切反应体系为：
[0041 ]
[0043] 混合体系置于37°C恒温水浴孵育5小时。
[0044] 3、向第2步酶切反应产物中补加产生3'末端粘性A末端所需的反应试剂，包括：
[0045]
[0046] 混合体系置于37°C恒温水浴孵育30min，75°C失活20min。
[0047] 4、向第3步加A反应产物中补加接头连接所需的反应试剂，包括：
[0048]
[0049] 混合体系置于20°C恒温金属浴孵育30min，65°C失活20min。
[0050] 5、对上述连接产物进行过柱纯化，步骤如下：
[0051] 1)连接产物中300yLCPBuffer，混匀后转入吸附柱中；
[0052] 2)室温，10, OOOg离心lmin，弃废液；
[0053] 3)加入700 yLDNAWashBuffer(确定已加入无水乙醇），室温，10, OOOxg离心 Imin，弃废液；
[0054] 4)室温，离心机最大相对离心力，离心2min;
[0055] 5) 35y LElutionbuff