金银花中环烯醚萜苷类化合物及其制备方法和用图
【技术领域】：
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及金银花中环烯醚萜苷类化合物及其制备方法，本 发明还涉及该类新化合物在制备降糖药物中的应用。
【背景技术】：
[0002] 糖尿病源于人体内胰岛素分泌不足，由此引发以糖代谢混乱为主的全身性疾病， 并伴随机体一系列的并发症，很难治愈，对患者的生活造成严重影响。糖尿病是世界范围的 最常见的流行性疾病之一，其死亡率在发达国家仅次于心血管疾病，恶性肿瘤，成为第三位 致死病因的疾病。α-糖苷酶抑制剂（例如阿卡波糖）临床上常被用作抗糖尿病药物，它们 能改善血管通透性和降低血糖水平。然而，长期使用一些α-糖苷酶抑制剂会对患者造成 过重的经济负担，最重要的是其副作用不良反应较大，对人的其他机体功能造成严重损害， 例如腹泻等肠道紊乱性疾病。因此有必要寻找新的、安全、有效的抗糖尿病的药物。许多中 药通过活血化瘀、消热解毒、补益的作用来改善人的各项机能，达到防治糖尿病的目的。而 且中药治疗糖尿病的作用机制、途径，具有多向性，多层面和多靶点的药理特点，有着西药 等化学合成药物不可比拟的优势。因此，从中药中寻找疗效确切的降糖天然药物，明确其药 效物质基础，进而开发出高效低毒的抗糖尿病新药，已成为目前国内外研究的热点。
[0003] 金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica)的干燥花蕾或带初开的花，为我 国常用中药，具有3000多年的历史。具有清热解毒、凉散风热之功效，主治痈肿疔疮、喉痹、 丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症。目前从金银花中报道分离得到多种类型化合物， 其中环烯醚萜苷类化合物具有很好降糖效果。因此从金银花中寻找降糖活性好的环烯醚萜 苷类化合物具有一定的价值。
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的旨在从金银花干燥的花蕾中寻找新的降糖前体药物，提供该环烯醚 萜苷类化合物的提取、制备方法，并且研究它们的降糖活性和医药用途。本发明的另一个目 的在于提供该类化合物的结构鉴定方法。
[0005] 本发明所述3个新的具有降糖活性环稀醚砲苷类化合物Loniceranan A、 Loniceranan B、Loniceranan C，其结构如下所不：
[0007] 本发明所述新的环烯醚萜苷类化合物的提取、制备方法如下：
[0008] 取干燥的金银花用水煎煮，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用大孔吸附柱色谱，以 乙醇-水系统0:100~100:1逐渐洗脱，共收集10~15个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并 为Al~A4, A2 (大孔树脂乙醇-水15:85~30:70下洗脱）通过聚酰胺柱色谱，以纯水进 行洗脱，洗脱液经减压蒸馏后得B，B经快速减压柱色谱以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇-水 系统50:1:0. 01~1:1:0. 01梯度洗脱，共得20~40个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合 并为Cl~C5, Cl经ODS柱色谱以甲醇-水系统10:90~100:0梯度洗脱得到20~30个 馏分，经分析液相检识，合并为Dl~D7,利用HPLC法以乙腈-水为流动相在D2-D5中制备 得到化合物1-3。其中，水煎煮提取2~5次，每次6~10小时。所述的乙腈-水的比例为 10:90-30:70。
[0009] 具体地，本发明中所述三个化合物的制备方法如下：
[0010] 取干燥的金银花花蕾10-15kg用水煎煮提取2~5次，每次6~10小时，药材与 水的比例为：1:3~1:5,合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用大孔吸附柱色谱，以乙醇-水系 统0:100~100:1逐渐洗脱，共收集10~15个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为Al~ A4, A2 (300~500g)通过聚酰胺柱色谱，以纯水进行洗脱，洗脱液经减压蒸馏得B，B经快速 减压柱色谱以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇-水系统50:1:0. 01~1:1:0. 01梯度洗脱，共得 20~40个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为Cl~C5, Cl经ODS柱色谱以甲醇-水 系统10:90~100:0梯度洗脱得到20~30个馏分，经分析液相检识，合并为Dl~D7,利用 HPLC法以乙腈-水为流动相（10:90-30:70)在D2-D5中制备得到化合物1-3。本发明所述 新的环烯醚萜苷类化合物具有较好的降糖活性。
[0011] 活性试验方法如下：
[0012] 1.实验材料
[0013] 1. 1受试品：化合物
[0014] L 2实验酶及来源α -糖苷酶
[0015] 2.实验方法
[0016] 2. 1药物处理
[0017] 称取I. 5mg样品至ImL EP管底部，加150 μ L PBS溶剂稀释至10mg/mL的溶液，储 存于-20°C。用时用相应的培养液将其稀释成10、5、2. 5、1. 25、0. 625mg/ml用。选取阿卡波 糖作为阳性对照药，称取lmg，加入10 μ L DMS0,再加入90 μ L PBS。配成约lmg/100 μ L的 溶剂。用时稀释成l〇、5、2. 5、1.25mg/ml用。选取α-糖苷酶作为反应酶，称取Img酶，加 ImL PBS溶解，配成lmg/mL的溶液，取10 μ 1稀释至I. 580mL。选取pNPG作为反应底物，称 取I. 51mg底物置IOmL EP管中，加 PBS至刻度，溶解，即为0. 5mM/L的底物溶液，避光保存。
[0018] 2. 2 MTT法的测定方法
[0019] 预先往96孔板孔里加入样品溶液50 μ L (磷酸缓冲液分别稀释成若干含量梯度）， 加入酶溶液（0. 1U) 100 μ L，37度孵育IOmin后，加入底物pNPG(0. 5mM) 50 μ L，孵育30min， 酶标仪上405nm处测定吸光度。
[0020] 抑制率（％ ) = [1-(A 样-A 空 V(A 对-A 空）]X100%
[0021] 2.3.统计方法
[0022] 全部资料采用SPSS (13. 0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值土标准误 (Mean土 S. E.)表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett ' s T3检验进行组间比较。
[0023] 3.实验结果
[0024] 表1化合物对α -糖苷酶的ICsn (mM/L)
[0027] 由上述实验结果可看本发明所涉3种化合物对α -糖苷酶具有一定抑制作用。其 中化合物2和3的作用明显，和阳性对照药阿卡波糖效果相当。化合物1对α -糖苷酶的 作用较弱。
[0028] 本发明所涉环烯醚萜苷类新化合物，对α -糖苷酶有一定的抑制作用，可用于开 发抗糖尿病类药物，尤其针对临床化疗阶段药物。
[0029] 本发明制备方法简单，重现性好，提取纯度高。获得的化合物具有较好的降糖活性 作用。
【附图说明】
[0030] 图 1 为 1 的 1H-NMR
[0031] 图 2 为 1 的 13C-NMR
[0032] 图 3 为 1 的 HSQC
[0033] 图 4 为 1 的 HMBC
[0034] 图 5 为 1 的 NOESY
[0035] 图 6 为 2 的 1H-NMR
[0036] 图 7 为 2 的 13C-NMR
[0037] 图 8 为 2 的 HSQC
[0038] 图 9 为 2 的 HMBC
[0039] 图 10 为 2 的 NOESY
[0040] 图 11 为 3 的1H-NMR
[0041] 图 12 为 3 的 13C-NMR
[0042] 图 13 为 3 的 HMBC
[0043] 图 14 为 3 的 NOESY
【具体实施方式】：
[0044] 制备实施例1
[0045] 取干燥的金银花花蕾IOkg用水煎煮提取3次，每次6小时，药材与水的比例为： 1:3,合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用大孔吸附柱色谱，以乙醇-水系统0:100、15:85、 30:70、50:50、IOO: O逐渐洗脱，共收集12个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为A1~A4， A2(350g)通过聚酰胺柱色谱，以纯水为流动相洗脱，洗脱液经减压蒸馏后得B，B经快速 减压柱色谱以二氯甲烷-甲醇-水系统50:1:0. 01、20:1:(λ 01、10:1:0. 01、5:1:(λ 01、 1: 1:0. 01梯度洗脱，共得35个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为Cl~C5, Cl经ODS 柱色谱以甲醇-水系统10:90、30:70、50:50、0:100、梯度洗脱得到24个馏分，经分析液相检 识，合并为Dl~D7。在D2(0DS甲醇水10:90洗脱）中以乙腈-水系统15:85在液相色谱 柱中制得化合物1和2,在D3(0DS甲醇水30:70洗脱）中以乙腈-水系统22:78在液相色 谱柱中制得化合物3。
[0046] 制备实施例2
[0047] 取干燥的金银花花蕾12kg用水煎煮提取4次，每次10小时，药材与水的比例为： 1:4,合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用大孔吸附柱色谱，以乙醇-水系统0:100、15:85、 30 :70、60:40、100:0逐渐洗脱，共收集10个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为Al~ A4，A2(400g)通过聚酰胺柱色谱，以纯水为流动相洗脱，洗脱液经减压蒸馏后得B，B经快 速减压柱色谱以二氯甲烷-甲醇-水系统50:1:0. 01、20:1:0· 01、15:1:0. 01、8:1:0. 01、 3:1:0. 01、1:1:0. 01梯度洗脱，共得25个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为Cl~C5， Cl经ODS柱色谱以甲醇-水系统10:90、35:65、50:50、0:100、梯度洗脱得到26个馏分，经分 析液相检识，合并为Dl~D7。在D3(0DS甲醇水35:65洗脱）中以乙腈-水系统15:85在 液相色谱柱中制得化合物1和2,在D4(0DS甲醇水35:65洗脱）中以乙腈-水系统20:80 在液相色谱柱中制得化合物3。
[0048] 制备实施例3
[0049] 取干燥的金银花花蕾Ilkg用水煎煮提取2次，每次7小时，药材与水的比例为： 1:3,合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用大孔吸附柱色谱，以乙醇-水系统0:100、15:85、 40 :60、70:30、100:0逐渐洗脱，共收集11个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为Al~ A