一种齐考诺肽的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肽类药物的纯化方法，尤其是一种齐考诺肽的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 齐考诺肽是人工合成的ω-MWA芋螺毒素，它首先作为致幻芋螺毒素的一种多 肽成分被报道。它的25个氨基酸序列为：Cys- Lys- Gly- Lys- Gly- Ala- Lys- Cys-Ser- Arg- Leu-Met- Tyr- Asp-Cys- Cys- Thr- Gly- Ser- Cys- Arg- Ser- Gly- Lys-Cys- NH2( 1-16)，（ 8-20)，（ 15-25) -tris( disulfide)。
[0003] 齐考诺肽对那些使用阿片类镇痛剂无效的严重慢性疼痛患者会产生显著的镇痛 作用，在临床研究中没有发现病人对齐考诺肽产生抗药性。目前，齐考诺肽已成为第 一种新型的神经治疗药物---N型钙离子通道阻断剂（NCCB)。作为一种非阿片类镇痛 剂，齐考诺肽与其他镇痛药物的区别在于其临床应用的安全性和有效性，从而预示了其 在严重慢性疼痛治疗中的重要的潜在价值。作为一种新型非吗啡类镇痛剂，该药物(商品名 Prialt)已分别于2004年底和2005年初获得美国FDA和欧盟的上市许可。
[0004] 齐考诺肽主要采用固相合成，环化而后经过制备HPLC纯化得到。有关齐考诺肽的 纯化工艺，较少有研究报道。专利CN201310202089. 5中主要介绍的是片段法合成齐考诺 肽，提到了使用IOum的C18填料色谱柱对齐考诺肽进行了纯化，专利CN200710301598. 8中 主要介绍的是使用不同的保护基保护巯基定向合成齐考诺肽，提到了使用C18填料色谱柱 对齐考诺肽进行了纯化，专利CN201310202216. 1中主要介绍的也是使用不同的保护基保 护巯基定向合成齐考诺肽，提到了使用C18填料色谱柱对齐考诺肽进行了纯化。这些文献 都没有对齐考诺肽的纯化工艺做进一步地研究，以适合工业化生产的要求。
[0005] 由于多对二硫键的存在，给齐考诺肽的纯化带来较大困难，体现在：1.在合成齐 考诺肽时，产生多种二硫键错配的杂质，这类杂质与产品很难分离，导致最终产品纯度低； 2.由于多对二硫键的存在，导致齐考诺肽分子立体结构上与一般多肽差异很大，常用填料 很难得到纯度较好的产品；3.多对二硫键在生产的过程中容易产生较多的多聚体，该多聚 体是最主要的杂质之一，本身极不稳定，易变色，严重影响齐考诺肽的色泽、含量及安全性。 本发明人经研究使用现有技术进行纯化发现，难以将多聚体杂质含量控制在0. 1%以下，同 时容易造成齐考诺肽收率降低。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的现有技术问题是提供了一种齐考诺肽的纯化工艺，能够很好地 解决上述问题，得到高收率、高纯度的齐考诺肽，进一步地能够将多聚体杂质控制在〇. 1% 以下，适合工业化生产。
[0007] 通常使用反相高效液相色谱进行多肽纯化时，小孔径的填料的比表面积较大，纯 化效果更好。但在实际应用中，我们发现含有多对二硫键的多肽在空间结构上的特殊性，导 致其在小孔径的填料上所获得的有效比表面积反而比大孔径填料的有效比表面积的小，多 聚体杂质不易除去，纯化效果不理想。
[0008] 本发明的技术方案是提供一种齐考诺肽的纯化方法，使用了一定范围内较大孔径 的填料，并在合适的制备条件下对齐考诺肽进行纯化。具体表现为，200-300A孔径的填料 效果好，更进一步得表现为，使用300A孔径的填料效果更好，尤其是针对多聚体杂质。
[0009] 本发明中一些常用的缩写具有以下含义； Fmoc :荷甲氧羰基 Fmoc-AA :荷甲氧羰基保护的氨基酸 DIC :N，N'-二异丙基碳化二亚胺 HOBt :1_羟基苯骈三唑 tBu :叔丁基 Trt :三苯甲基 Boc :叔丁氧羰基 Pbf :2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基 Cys :半胱氨酸 Lys :赖氨酸 Gly :甘氨酸 Ala :丙氨酸 Ser :丝氨酸 Arg :精氨酸 Leu :亮氨酸 Met :甲硫氨酸 Tyr :酪氨酸 Asp :天冬氨酸 Thr :苏氨酸 DMF :N，K -二甲基甲酰胺 MeOH :甲醇 DCM :二氯甲烷 TFA :三氟醋酸 EDT :乙二硫醇 PhSMe :苯甲硫醚 Piperidine :六氢P比啶 DIEA :N，K -二异丙基乙胺 为此本发明提供一种齐考诺肽的纯化方法，其特征包括以下步骤： (1) 使用三氟醋酸调节齐考诺肽粗品溶液PH为3-4 ; (2) 按体积分数设置梯度，使用50%流动相B冲洗反相填料柱lOmin，然后用5%流动相 B等度洗脱平衡IOmin ; (3) 将（1)溶液载入反相填料中； (4) 按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持5分钟，然后在60 分钟内将流动相B比例增至22%，收集洗脱馏分； (5)将洗脱馏分经过转盐、浓缩、冻干后得到齐考诺肽精肽； 其中，反相填料柱为：（1〇 μπι，200~300 A，50 mm X250 mm); 流动相A :0. 3%醋酸水溶液； 流动相B :乙腈； 梯度程序为：洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持5分钟，然后在60分钟内将流 动相B比例增至22% ; 流速为：80 mL/min ; 检测波长为：220 nm〇
[0010] 本发明提供的方法经过大量试验筛选，从而获得较为理想的实验条件如下： 1. 填料孔径的选择 填料孔径：12〇A、20〇A、30〇A 2. 流动相A类型选择 0. 1%TFA水溶液、0. 3%醋酸水溶液 3. 填料类型选择 硅胶C18反相填料、多聚体UniPS ? 10反相填料 针对齐考诺肽的纯化我们同样进行了以下5个实验条件： 实验条件I : (1)样品处理：将齐考诺肽粗肽溶液，用TFA调节pH为3-4 ; (2)冲柱、平 衡：使用50%流动相A冲洗反相填料柱IOmin ;然后用5%流动相A等度洗脱平衡IOmin ;其 中，硅胶C18反相填料柱为（10 μ m，120A，50 _ X 250 mm);流动相A :0. 1%TFA水溶液； 流动相B :乙腈；（3)上样：将样品溶液载入制备柱中；（4)洗脱：梯度程序为：洗脱梯度的 初始状态流动相B为5 %，保持5 min，再然后60 min内将流动相B比例增至22% ;流速为： 80 mL/min ;检测波长为 220 nm ;中控检测：用 Vydac C18 (5um 300A 4. 6*250mm)色谱柱； 以25mM高氯酸钠：甲醇：TFA=98:2:0. 05为流动相A，水：乙腈：TFA=50:50:0. 05为流动相 B;流速为2.0ml/min;柱温为40 °C;检测波长为205 nm;洗脱梯度的初始状态为0 %流动 相B，保持2 min，然后在12 min内将流动相B升至30 %，保持5 min，然后在10 min内将 流动相B升至70 %，在I min内回到初始状态，保持6min ; (5)转盐、浓缩、冻干后得到齐 考诺肽精肽。
[0011] 实验条件2- 8,实验操作如实验条件1所示，各实验条件及实验结果如下：
以上结果表明，填料孔径200A-300A的纯化效果好，300A的纯化效果较理想，其中 30〇A/UniPS_: 10的纯化效果最好。
[0012] 对同样的齐考诺肽粗肽进行了对比实验，使用现有技术CN201310202089. 5中的 纯化工艺和本发明的最优方法分别如实施例4和实施例5所示，本发明的最优方法具有显 著优势，有关对比实验结果如下：
本发明的有益效果是：提供了一种高纯度、高收率以及低成本的齐考诺肽纯化方法，其 中特别可以很好的控制多聚体杂质。
【附图说明】
[0013] 图1齐考诺肽精肽HPLC谱图。
[0014] 图2齐考诺肽精肽多聚体检测谱图。
[0015] 图3齐考诺肽质谱谱图。
【具体实施方式】
[0016] 以下通过实施例进一步说明本发明。
[0017] 具体地，关于下面实施例中涉及的各商购氨基酸以及氨基酸片段，以及各商购树 月旨，其生产厂家和商品型号如下： Fmoc保护基氨基酸原料、2-CTC树脂均为常规的市售试剂(厂家：吉尔生化(上海）有限 公司；化学纯)。
[0018] 有机溶剂和其它原料来源均为市售品（厂家：国药集团化学试剂有限公司；化学 纯)。
[0019] 纯化填料：Daisogel SP-120-10-P，Daisogel SP-200-10-P，DaisogelSP-300-10-P，苏州纳微UniPS麵10。
[0020] 另外，下面实施例中提到的"旋蒸浓缩"以及"冻干"以及测定HPLC和质谱的条件 和所用设备型号及生产厂家说明如下： 制备HPLC :创新通恒。
[0021] 旋蒸浓缩设备：旋转蒸发仪R-200/205 (瑞士 Buchi (布奇）公司）； 旋蒸浓缩条件：30°C下，真空（-0.1 Mpa)条件下旋蒸浓缩，浓缩后体积在旋蒸前总体积 75%以下。
[0022] 冻干设备：冻干机FD-3 (北京博医康实验仪器有限公司）； 冻干条件：将冻干盘放入冰箱冷冻室（-20°C)中，预冻6 h。开启冻干机，打开制冷， 预冷30 min以上，设置冻干曲线如下： 第一段：在-27 °C运行16 h ;第二段：在-5°C运行4 h ;第三段：在5°C运行2 h ;第四 段：在30°C运行16 h。
[0023] HPLC :用 Vydac Cl8 (5Um 300A 4. 6*25〇mm)色谱柱；以 25禮高氯酸钠：甲 醇：TFA=98:2:0. 05为流动相A，水：乙腈：TFA=50:50:0. 05为流动相B ;流速为2. Oml/min ; 柱温为40 °C;检测波长为205 nm;洗脱梯度的初始状态为O %流动相B，保持2 min，然后 在12 min内将流动相B升至30 %，保持5 min，然后在10 min内将流动相B升至70 %， 在I min内回到初始状态，保持6min。
[0024] 凝胶色谱（多聚体检测）：色谱柱：TSK GEL 2000 SWXL 5μπι 7. 8*300mm;流动相： TFA:乙腈：水=0. 05 :35 :65 ;柱温：30°C;流速：0. 8ml/min ;检测波长：215nm ;梯度：等度洗 脱30分钟。
[0025] 实施例1:齐考诺肽的固相合成 称取取代度为0.40mmol/g的Rink Amide AM树脂25g，加入到固相反应柱中，加入 到固相反应柱中，用DCM洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，用DMF:吡啶体积比为 4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，称取17. 57g Fmoc-Cys (Trt) -OH (30mmol)、4.05g HOBt (30mmol)加入体积比为