偶联重组Pro-A和/或G多糖亲和介质及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物材料领域，更具体地讲，涉及新一代偶联重组Pr0-A和/或G多糖 亲和介质及其应用。
【背景技术】
[0002] Kohler和Milstein于1975年发明了被称之为"魔弹"的单抗技术，并在1984年获 得了诺贝尔奖。单抗是由B淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生，其重链和 轻链所形成的结构域可以识别和结合特异性抗原。1987年单抗技术被成功应用到诊断试剂 当中，但由于HAMA(人抗鼠抗体）反应，没能有效应用在人类疾病的治疗上。90年代，随着 基因工程技术的迅速发展，治疗性单抗从早期100%的鼠源性单抗（Mab)，到嵌合抗体，人 源化抗体（Humanized Mab)，到近年的全人源性抗体，逐步消除了抗体的免疫源性问题，在 保持对抗原高亲和力的同时，改善了抗体的药动力学。1997年FDA批准第一个治疗淋巴癌 的嵌合单抗药物Rituxan，抗⑶-20单抗上市，并进入56个国家，由IDEC/Genentech/Roche 三大药厂联合生产，至今仍然供不应求。抗体药物的主要治疗机制是：（1)直接诱导癌细胞 凋亡或抑制癌细胞生长和代谢，或通过补体效应或ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作 用）间接杀死癌细胞。（2)癌症、心血管等疾病的导向治疗：以单抗荷载同位素、毒素蛋白、 抗生素等药物制成生物导弹。（3)应用抗T细胞、抗IL-2R的单抗防治器官移植排斥反应 等。（4)以单抗制成避孕、传染病的预防药物。
[0003] 1986-2014年美国FDA审批的抗体药物为48个，占全部生物药物的38. 40%，由此 可见抗体药物逐渐成为生物药物的主宰。二十世纪八十年代末，抗体药物仅占生物药物的 10% ;进入九十年代后随着抗体技术的迅速发展抗体药物在肿瘤、消化、免疫、呼吸、泌尿、 骨骼肌疾病、疾病诊断等不同领域广泛应用。2014抗体药物已经占到2014年审批生物药物 的55%。已上市的抗体有不少已成为年销售额数亿美元的"重镑炸弹药物"（Blockbuster Drug)。全球抗体药物的市场增长十分迅猛，有约200多种单抗在临床实验，占整个临床生 物技术药品总数的三分之一多，其中四分之一在临床三期或等候批准。抗体的销售额也在 逐年提高，仅2013年北美处方药销售前100位中有10个是单克隆抗体药物。2000年人类 基因组测序完成，近年蛋白质组和结构基因组技术的蓬勃发展，也给抗体研究带来更多机 遇和挑战。国内正在推动的抗原表位组学、抗体组学和抗体药物组学，将对中国抗体技术的 发展起到很大的促进作用。
[0004]目前抗体分离方法很多，主要有硫酸铵沉淀法，辛酸沉淀法，DEAE离子交换层析 法，羟基磷灰石层析法，凝胶层析法，以及上述方法相结合的联合分离方法以及Protein A 亲和层析法，Protein G亲和层析法，抗原亲和层析法和抗抗体亲和层析法。在这些方法中， rProtein A和Protein G相结合的Protein A/G亲和层析是分离、纯化高效价、高纯度的抗 体较好的方法之一。其中的Protein A，即A蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白，分子量为 42KD，有5个不同的IgG结合位点，不同的位点独立地与抗体结合Fc片段特异性结合。但 IgA，IgM，IgE也可能结合在protein A上，当达到饱和时，一个A蛋白分子至少可以结合两 个IgG分子。A蛋白对IgG有高亲和力和特异性，这一特点使之非常适合用于纯化腹水或 细胞培养上清中的单克隆抗体。Protein G，即G蛋白是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋 白，一种三型Fc受体。其通过类似于A蛋白的非免疫机制与抗体的Fc段结合。像A蛋白 一样，G蛋白与IgG的Fc区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose还可以特异性 低亲和地与重链的CHl及轻链的(^结合而用于纯化Fab及F(ab'）2。另外，ProteinG可以 广泛、更强地结合许多类型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度 更高，配体脱落也相对更低。
[0005] 每个单抗等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单 抗的纯化方法，既要了解他们的共性，又要了解个性，Protein A Sepharose、rProtein A Sepharose亲和层析介质与抗体的结合。目前，约70-80%的抗体纯化使用了 Protein A、 Protein G亲和层析。A蛋白作为亲和配体被固定于琼脂糖上，它所包含的5个与IgG Fe 段结合的结构域被空出来以便捕捉IgG。1个A蛋白分子至少可以结合2个IgG。A蛋白也 可以结合另一些免疫球蛋白与如]^六、]^1。天然和重组的4蛋白（冲1'(^6；[11六）对于]^6的 Fc段有着相似的特异结合。重组的A蛋白经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位 点固定于琼脂糖上，增加了与IgG的结合能力。A蛋白与IgG的结合强度依赖于该抗体的物 种来源，而其动态结合能力则决定于结合强度及其他因素（例如上样时的流速）。Protein G Sepharose亲和层析介质可以广泛、更强地结合许多类型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同 时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配体脱落也相对更低。
[0006] 由于不同抗体与A蛋白或G蛋白的亲和力不同，有必要单独优化结合和洗脱条件 和层析柱载量，过程可以通过用自动化层析系统如AKTA来完成。以下是一个杂交瘤细胞培 养单抗的纯化条件探索。虽然70-80%的抗体纯化用Protein A、Protein G亲和层析一步 就可以达到90-95%以上的纯度，但是要在克级甚至公斤级生产规模达到最终产品的质量 要求，往往需要多维层析纯化。2003年初，中国SFDA属下的NICPBP(中国药品与生物制品 检定所）公布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》。生产者除须保证最终抗体产 品纯度，还需要验证所用的纯化方法能有效对可能存在的非目标产物污染，如宿主杂蛋白、 免疫球蛋白、DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、其它热原物质、培养液成分、层析柱 析出成分进行去除，并能有效的去除/灭活病毒。也就是说，在设计下游工艺时，需多方充 分综合考虑抗体本身的性质，抗体的来源，发酵培养技术，发酵液蛋白浓度，宿主杂质，抗体 批间的差异，潜在污染及病毒灭活等问题。目前，用CHO细胞大规模生产（超过一万升发酵 罐）的单抗表达水平已在〇. l_2g/L，小规模表达水平达5g/L。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的在于提供一种新一代偶联重组Pro-A和/或G多糖亲和介 质。
[0008] 本发明的第二个目的在于提供偶联重组Pro-A和/或G多糖亲和介质在分离和纯 化抗体类蛋白质中的应用。
[0009] 为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：偶联重组Pro-A和/或G多糖 亲和介质，其特征在于，所述重组Pro-A具有3个B结构域串联，避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异，所述重组Pro-G去除了白蛋白和细胞表面结合域，以减少非特异性结合， 且重组Pro-G仅含有C-末端的三个由55个氨基酸组成的抗体结合结构和两个由16个氨 基酸组成的间隔区域，所述亲和介质是偶联A和/或G蛋白的多糖凝胶颗粒。
[0010] 作为一个优选方案，所述重组Pro-G的C末端融合了 3xCys标签。
[0011] 作为一个优选方案，所述重组Pro-A的蛋白质序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 重组 Pro-Α 的蛋白质序列：MHHHHHvhvvk pgdtvndiak angttadkia adnkladknm ikpgqelvv vhvvk pgdtvndiak angttadkia adnkladknm ikpgqelvv vhvvk pgdtvndiak angttadkia adnkladknm ikpgqelvv CCC (SEQ ID NO. I)〇
[0013] 作为一个优选方案，所述重组Pro-G的蛋白质序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0014] 重组 Pro-G 的蛋白质序列ykli lngktI kgettteavd aataekvfkq yandngvdge wtyddatktf tvtekpevid aseltpavtt yklvingktl kgettteavd aataekvfkq yandngvdge wtyddatktf tvtekpevid aseltpavtt yklvingktl kgetttkavd aetaekafkq yandngvdgv wtyddatktf tvteCCC(SEQ ID NO. 2)〇
[0015] 为实现以上第二个目的，本发明公开以下技术方案：偶联重组Pro-A和/或G多糖 亲和介质在分离和纯化抗体类蛋白质中的应用。
[0016] 作为一个优选方案，所述抗体是指诊断或治疗性抗体或其抗原结合部分。
[0017] 作为一个优选方案，所述抗体或其抗原结合部分包括多价抗体、人源化抗体、嵌合 抗体或纳米抗体、基因工程改造抗体。
[0018] 作为一个优选方案，所述诊断或治疗性抗体或其抗原结合部分包括但不限于抗肿 瘤、感染性疾病、糖尿病、老年痴呆症的抗体或其抗原结合部分。
[0019] 本发明的优点在于：（1)高特异性：对抗体及其类似蛋白质有专一的亲和力；（2) 吸附力强：每个蛋白A或蛋白G分子含有5个抗体结合域，可以与抗体分子充分结合；（3) 高稳定结合蛋白A/G :树脂可重复利用，结合力几乎保持不变。
【附图说明】
[0020] 图1为proteinA/G凝胶纯化抗体原理。
[0021] 图 2 为 Protein G 纯化。
[0022] 图3为利用protein G从小鼠腹水中纯化抗体。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合