一种抗her2双特异性抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗体及其制备与应用；特别是涉及一种抗HER2双特异性抗体及 其制备方法与应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一，资料统计表明其发病率占全身各种 恶性肿瘤的7%_10%。每年全世界约有120万乳腺癌新发病例，约有50万女性死于乳腺癌。 HER2基因为乳腺癌的主要致病相关基因，其产物在20%-30%的患者中有过表达现象，HER2 过度表达提示患者预后不良，并对细胞毒性化疗药产生抵抗（Slamon DJ，Clark GM，Wong SG, Levin WJ，Ullrich A，McGuire WL Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987Jan9;235(478 5):177-82)。
[0003] 人类表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor)家族有 4 个成员：EGFR、HER2 (人类表皮生长因子受体2)、ErbB3和ErbB4,广泛表达于上皮、间质及 神经组织，生理状态下它们参与激活一系列复杂的细胞信号转导途径，调控正常组织细胞 的生长、分裂、分化等重要生理过程。然而研究表明某些肿瘤的发生、发展及恶性生物学 行为与EGFR家族的异常表达和活化关系密切（Albanell J，Codony J，Rovira A，Mellado Bj Gascon P. Mechanism of action of anti-HER2monocIonal antibodies: scientific update on trastuzumab and2CM· Adv Exp Med Biol. 2003;532:253-68XHER2 没有天然配 体，在单体状态下无活性，当形成二聚体时可使酪氨酸激酶活化，激活MPK和PI3K/Akt通 路，最终导致肿瘤细胞增殖和存活（Hudis CA. Trastuzumab-mechanism of action and use in clinical practice. N Engl J Med. 2007Jul5;357(l):39_51)〇
[0004] 抗HER2人源化单克隆抗体Trastuzumab (商品名Herceptin，曲妥珠单抗，赫 赛汀）是美国Genentech公司研制的针对HER2的人源化单克隆抗体，于1998年获得美 国FDA批准用于HER2高表达转移性乳腺癌的治疗。但Trastuzumab的客观反应率仅 为 30% (Vogel CL，Cobleigh MA，Tripathy D，Gutheil JC，Harris LN，Fehrenbacher L，Slamon DJ，Murphy M，Novotny WF，Burchmore M，Shak S，Stewart SJjPress M. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-〇verexpressing metastatic breast cancer.J Clin Oncol. 2002Feb I; 20 (3) : 719-26 ；Nahta RjYu DjHung MCjHortobagyi GNjEsteva FJ. Mechanisms of disease:understanding resistance to HER2_targeted therapy in human breast cancer. Nat Clin Pract Oncol. 2006May; 3 (5) : 269-80 ；Ktimler IjTuxen MKjNielsen DL. A systematic review of dual targeting in HER2-positive breast cancer. Cancer Treat Rev.2014;40(2):259-70.)。而且Trastuzumab是一个人源化抗体，保留了鼠源CDR区和少 量FR区鼠源残基，仍未能达到全人源化。研制更为有效的抗HER2治疗性抗体是临床治疗 的迫切需求。
[0005] 噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最为广泛的抗体库。噬菌体展示是一种将 外源蛋白基因与噬菌体的衣壳蛋白基因相融合后使外源蛋白表达呈现于噬菌体表面的技 术。噬菌体抗体库就是利用了以上原理使不同特异性的抗体表达在不同的噬菌体表面而用 抗原对它们进行筛选。用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以是杂交瘤细胞、免疫的人B细 胞或未经免疫的人B细胞。未经免疫的人B淋巴细胞是目前应用最多的靶细胞，它库容量 大，理论上含有所有的人源抗体基因。噬菌体抗体库的筛选就是模拟体内抗体亲和力成熟 的过程，用固相化抗原吸附表面表达特异性抗体的噬菌体库，然后洗脱游离的噬菌体，用抗 原吸附的噬菌体感染宿主菌增殖扩增后再进行多轮的"吸附一洗脱一扩增"直至筛选到特 异的人源抗体。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种抗HER2双特异性抗体及其制备方法与应用，该抗体是 全人源化抗体，对乳腺癌细胞具有较强的抑制作用。
[0007] 本发明提供的一种抗体，由两个相同的半分子组成，其中每个半分子由通过二硫 键连接的一条轻链和一条重链组成，所述两个半分子的两条重链之间通过二硫键连接；所 述重链的氨基酸序列如SEQ ID No. 19所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No. 20所示。
[0008] 上述抗体中，所述重链的编码基因序列如SEQ ID No. 17中自5'末端起第73位至 第1824位核苷酸所示；
[0009] 所述轻链的编码基因序列如SEQ ID No. 18中自5'末端起第82位至第1146位核 苷酸所示。
[0010] -种制备上述任一所述抗体的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将 含有SEQ ID No. 17所示DNA分子的重组表达质粒和含有SEQ ID No. 18所示DNA分子的重 组表达质粒导入离体的哺乳动物细胞中，筛选得到稳定表达目的抗体的转染细胞，再将其 扩大培养，纯化得到目的抗体。
[0011] 上述方法中，所述含有SEQ ID No. 17所示DNA分子的重组表达质粒为将SEQ ID No. 17所示的DNA分子插入pcDNA3. 1 (+)的Hind III和EcoR I位点间得到；
[0012] 所述含有SEQ ID No. 18所示DNA分子的重组表达质粒为将SEQ ID No. 18所示的 DNA分子插入pcDNA3. 1 (+)的Hind III和EcoR I位点间得到。
[0013] 上述任一所述的方法中，所述哺乳动物细胞为CH0-K1细胞；
[0014] 所述扩大培养时所用的培养基为EX-CELL302无血清培养基，该培养基购自 SIGMA-ALDRICH 公司。
[0015] 上述任一所述的抗体在制备抗人类表皮生长因子受体2的产品中的应用也属于 本发明的保护范围。
[0016] 上述任一所述的抗体在制备抑制乳腺癌细胞生长和/或增殖的产品中的应用也 属于本发明的保护范围。
[0017] 所述乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞；
[0018] 所述人乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞BT-474、人乳腺癌细胞HCC-1569或人乳 腺癌细胞HCC-1419。
[0019] 上述任一所述的抗体在制备抑制乳腺癌细胞在动物体内形成肿瘤的产品中的应 用也属于本发明的保护范围。
[0020] 所述乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞；
[0021] 所述人乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞BT-474或人乳腺癌细胞HCC-1569。
[0022] 上述任一所述的应用中，所述乳腺癌细胞为高表达抗人类表皮生长因子受体2的 乳腺癌细胞。
[0023] 上述任一所述的抗体在制备抗乳腺癌药物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024] 上述应用中,所述乳腺癌为人乳腺癌。
[0025] 本发明提供的抗HER2双特异性抗体HER2-BsAb具有显著的抑制HER2高表达的乳 腺癌细胞体外增殖活性以及体内成肿瘤作用，表明该抗体在乳腺癌的治疗中具有广阔的应 用前景。
【附图说明】
[0026] 图1为抗HER2单克隆抗体对乳腺癌细胞BT-474的体外生长抑制活性。
[0027] 图2为抗HER2单克隆抗体对乳腺癌细胞HCC-1569的体外生长抑制活性。
[0028] 图3为抗HER2单克隆抗体对乳腺癌细胞HCC-1419的体外生长抑制活性。
[0029] 图4为抗HER2单克隆抗体对BT-474乳腺癌的体内抗肿瘤作用。
[0030] 图5为抗HER2单克隆抗体对HCC-1569乳腺癌的体内抗肿瘤作用。
[0031] 图6为抗HER2双特异性抗体对乳腺癌细胞BT-474的体外生长抑制活性。
[0032] 图7为抗HER2双特异性抗体对乳腺癌细胞HCC-1569的体外生长抑制活性。
[0033] 图8为抗HER2双特异性抗体对乳腺癌细胞HCC-1419的体外生长抑制活性。
[0034] 图9为抗HER2双特异性抗体对BT-474乳腺癌的体内抗肿瘤作用。
[0035] 图10为抗HER2双特异性抗体对HCC-1569乳腺癌的体内抗肿瘤作用。
【具体实施方式】
[0036] 以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
[0037] 实施例不包括对传统方法的详细描述，如：0verlapping PCR反应，限制性酶切 反应，将基因插入到质粒载体，将质粒引入宿主细胞的方法等。这样的方法对于本领域 中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如Sambrook， J. , Fritsch, E. F. and Maniais, T. (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039] 人乳腺癌细胞 BT-474 购自 American Type Culture Collection (ATCC)，产品目 录号为HTB-20。
[0040] 人乳腺癌细胞HCC-1569购自ATCC，产品目录号为CRL-2330。
[0041] 人乳腺癌细胞HCC-1419购自ATCC，产品目录号为CRL-2326。
[0042] pGEM-T 载体购自 Promega 公司。
[0043] pcDNA3. 1 (+)购自 Invitrogen 公司。
[0044] CH0-K1细胞购自ATCC，产品目录号为ATCC CRL-9618。
[0045] Lipofectamine2000Reagen