一种产曲酸真菌菌株及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物真菌分离培养，具体涉及产曲酸菌株的分离培养。
【背景技术】
[0002] 曲酸是由米曲霉等微生物产生的一种酸性代谢产物，能溶于水、乙醇或醋酸酯 等。能产生曲酸的微生物多数为真菌，如米曲霉、米黄曲霉、黄曲霉、亮白曲霉、棒曲霉、巨 大曲霉、烟曲霉、溜曲霉、温特曲霉和灰绿曲霉。某些细菌如玫瑰葡糖杆菌、蜡状葡糖杆菌 和若干假单胞菌也可利用糖类生成曲酸 Arbakariya B. Ariff et al. , Kojic acid: Applications and development of fermentation process for production. Biotechnology and Molecular Biology Reviews Vol. 5(2), pp. 24-37, 2010)〇
[0003] 持续开展高产曲酸微生物菌株分离及培养使其具有工业用途很有必要。这是因 为，曲酸用途广泛，集抗菌、防腐、保鲜、护色发色、抗氧化等作用于一身。作为食品添加剂， 其食品防腐剂的性能比山梨酸更理想；也可作为生鲜蔬菜、水果、海产品等的保鲜，而在护 色发色上可部分取代亚硝酸钠，并能抑制亚硝酸盐转化为致癌的亚硝胺。曲酸作为酪氨酸 酶抑制剂，抢先与酪氨酸酶中的铜离子螯合，使铜离子失去作用，抑制多巴色素的合成。曲 酸能抑制5,6-二羟基吲哚，即DHI的聚合，抑制DHICA氧化酶的活性。
[0004] 添加曲酸的化妆品有护肤、润肤、美白、光亮、防晒、祛斑的功能。尽管曲酸在化 妆品中的生物安全性在一段时间内引起较多争论，但最新证据表明：曲酸在化妆品中的 添 tW;獻衝安全饱〈Christina L. Burnett, Wilma F. Bergfeld, F. Alan Andersen， et al. Final report of the safety assessment of kojic acid as used in cosmetics. International Journal of 29 (Supplement 4)，244S-273S， 2010)。可以预见，随着更多安全性评价证据的支持，曲酸在日化领域的应用还具有很大延 伸空间。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在通过分离和筛选而提供一种曲酸合成微生物一集峰曲霉 FECH-998菌株，并以该菌株为产曲酸的候选菌株，提供发酵条件及 菌株育种优化方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现上述技术发明目的。
[0007] (-）一种产曲酸化合物的真菌菌株 该菌株为集峰曲霉 λολζΛλ?) FECH-998,保藏编号为CGMCC No :10987,所 述菌株FECH-998所产的铁螯合化合物化学结构式如附图3所示。 (二）制备产曲酸化合物的真菌菌株的方法 包括以下步骤： (1)制备孢子悬液及液体培养液 将菌株FECH-998接种于去铁查氏琼脂培养基的琼脂斜面上，斜面试管规格为 015X150 mm，该琼脂培养基体积5 mL，28°C培养4~7 d，待菌丝体形成大量孢子后，向斜 面加入5 mL无菌去离子水，灭菌竹签轻刮洗菌苔制成孢子悬液； 将菌株FECH-998孢子悬液分别接种到装有去铁查氏基础培养基的3支试管中，试管规 格为015 X 150 mm，该基础培养基体积5 mL，28°C培养7 d，待基础培养基表面出现大量菌丝 生长及孢子时以其作为基础培养液； 所述的去铁查氏琼脂培养基（g/L) =NaNO3 2.0 g、K2HP04 1.0 g、KCl 0.5 g、MgS04 0.5 g、鹿糖30. 0 g、琼脂20. 0 g、去离子水I L、pH自然，配好后121°C灭菌20 min ; 所述的去铁查氏基础培养基与去铁查氏琼脂培养基的成分区别是：去铁的查氏基础培 养基不加入琼脂，其余成分相同； (2) 筛选 用96孔板每孔中加入20微升CAS染液和等体积的步骤（1)的液体培养液，充分混合， 以颜色反应为红色或橘红色或棕黄色或紫色的真菌作为候选菌株，将其按步骤1方法制备 孢子悬液，接种到IOOmL去铁查氏基础培养基中，28°C、180rpm培养5d ; 用96孔板每孔中加入40微升CAS染液和等体积的候选菌株培养液，充分混合，记录颜 色变化时间，将反应用时最短、反应颜色变化差异大的菌株FECH-998作为优选菌株； (3) 制备发酵粗提取物 取步骤（2)10支FECH-998菌株制备孢子悬液接种于10X200 mL灭菌液体去铁查氏培 养基中，28°C，180 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长停止培养，以该培养液为种 子液； (4) 取步骤（3)种子液，按10%接种比例用无菌吸管将其平均接种到50瓶各装有200 mL灭菌去铁查氏基础培养基的500 mL三角瓶内，28°C~32°C，180 rpm培养3 d~8 d，待 培养液内有大量菌丝球生长时按2%比例向三角瓶内投放粒径60~16目的大孔吸附树脂， 28°C~32°C，180 rpm原位吸附24 h后停止培养，收集培养液，过滤；菌渣和树脂用甲醇提 取，滤液用乙酸乙酯萃取，得到甲醇提取物和乙酸乙酯萃取物； (5) 将甲醇提取物减压浓缩、干燥，得到夹杂大量白色细针状结晶的黄色油状物23. 8 g;将乙酸乙酯萃取物减压浓缩、干燥，得到夹杂大量白色细针状结晶的棕浅棕色固型物 11. I g，合并二者，作为粗提物。
[0008] 进一步，所述的制备方法是：所述步骤（4)是以高糖培养基取 代去铁查氏基础培养基，该高糖发酵培养基（g/L)为：蔗糖100.0 g、酵母膏6.0 g、 NaNO3 2. 0 g、K2HPO4 I. 0 g、KCl 0· 5 g、MgSO4 0· 5 g、去离子水 I L、pH 自然；配好后 121 °C 灭菌20 min ;所述高糖培养基的发酵液中曲酸含量为15. 65g/L，曲酸转化比例为0. 157g曲 酸/g蔗糖。
[0009] 进一步，所述的制备方法是分离纯化步骤（5)粗提物，包括： (1) 正相硅胶柱层析梯度洗脱，该层析系统梯度为：氯仿、氯仿：甲醇=9:1及甲醇；CAS 液体显色法追踪各段洗脱液含有铁螯合活性成分的馏分； (2) 馏分减压蒸干活性成分，用石油醚洗涤除去油状物，甲醇溶解，室温下反复结晶和 重结晶获得白色细针状化合物，该化合物具有很强的铁螯合活性。
[0010] 本发明具有以下实质性特点和进步： 本发明以分离自碱性限铁环境土壤样品的100株真菌菌株为材料，以CAS显色原理为 指导筛选不同层次的筛选模型，获得模型中铁螯合物质活性强的集峰曲霉FECH-998微生 物菌株。经过分子生物学鉴定，FECH-998被鉴定为集峰曲霉floaziiAs)菌株。 该菌株于2015年6月17日在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"（地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101)进行了有效保藏，保藏编号为CGMCC No: 10987。
[0011] 本发明进一步以集峰曲霉FECH-998为出发菌株进行液体培养，划段初分粗提取 物，并通过考察菌株产曲酸能力以高糖培养基为种子液的液体培养基使发酵液中曲酸含量 提高到15. 65g/L，曲酸转化比例为0. 157g曲酸/g蔗糖。
[0012] 除此之外，本发明还提供了活性部位纯化精制、指认活性物质化学结构等获得目 标化合物的步骤。
[0013] 本发明表明：菌株FECH-998野生菌株合成曲酸营养要求简单、生长迅速、产孢量 大、后期菌株育种空间大，具有作为产曲酸高产菌株的良好潜力。
【附图说明】
[0014] 图 1 为菌株 FECH-998 与标准菌株 NRRL13137 ITS 序列的系 统进化树。