一种死亡谷芽胞杆菌nbif-001及发酵方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种死亡谷芽胞杆菌NBIF-001及发 酵方法和应用。
【背景技术】
[0002] 西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. Niveum)病 原菌引起的，在土中存活时间较长（8~10年）。该病害在我国的发生面积约为总栽培面 积的42%，造成减产15%，重者达85 %甚至绝收，导致西瓜品质降低（含糖量下降等），是 危害最为严重、造成经济损失最大的病害之一。该病从苗期到坐果期均可发生，以坐果初期 发病最为严重。苗期的发病苗，茎、叶因失水而枯萎、倒伏，根部的根毛枯萎、脱落，茎基部出 现皱缩，呈现淡紫色或浅褐色。坐果初期发病，植株下部茎叶枯萎发黄，几天后迅速扩散到 整个植株，直至完全枯死。病情扩展很快，几天至十几天便可蔓延全田。生产中采用多种方 法防治这种病害，如嫁接防治、抗病育种、农业防治、化学防治和生物防治等。但由于目前西 瓜枯萎病防治手段不能高效杀菌，抗病品种选育难度大，病原菌生理小种的不断分化，抗药 性、致病力增强，农耕技术水平低下等原因，对我国西瓜生产造成很大影响，严重挫伤了生 产者的积极性。寻找一种经济、安全、高效的防治方法是当务之急。近年来，根际生防菌的 研究为西瓜枯萎病的生物防治提供了新途径，许多根际有益微生物既能够产生多种抗菌物 质直接抑菌，又能够诱导植物产生系统抗性，使植物获得广谱抗病能力。因此根际生防菌诱 导植物产生的防护作用安全而有效，在植物病害生物防治中具有重要的应用价值。
[0003] 目前应用于生物防治的芽胞杆菌种类主要有苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis)、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)、多粘芽胞杆菌（Bacillus polymyxa)、錯状芽胞杆菌（Bacillus cereus)、地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium)、短小芽胞杆菌（Bacillus pumilis)等。通过同化作用产生抗菌物质，抑制有 害病原物的生长或者直接杀灭病原物，是生防芽胞杆菌防治植物病害的重要机制之一。芽 胞杆菌产生的拮抗物质主要有抗生素、抗菌蛋白及挥发性抗菌物质等，其中脂肽抗生素是 一个较大的类群。它们易于繁殖，适应环境能力强，具有很大的开发利用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种死亡谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis)，申请人 将其命名为死亡谷芽胞杆菌NBIF-001，该菌株于2015年3月6日送至中国典型培养物保藏 中心（CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO :M2015087,分类命名：死亡谷芽胞杆菌（Bacillus V allismortis)NBIF-001，地址：中国武汉武汉大学。
[0005] 本发明还有一个目的在于提供了死亡谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis) NBIF-001的发酵方法，方法简单，易行。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供死亡谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis) NBIF-OOl的应用，包括在制备防治西瓜枯萎病药物中的应用；还包括在制备番茄枯萎病 菌、番茄早疫病菌、禾谷镰刀菌、小麦赤霉病菌或水稻纹枯病菌抑制剂中的应用；还包括在 制备防治黄瓜灰霉病药物、或防治水稻纹枯病药物中的应用；还包括在制备抑螨药物中的 应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下
[0008] 死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株的分离与培养：
[0009] 申请人自云南香格里拉的土壤样品，通过高温筛选，获得了一株死亡谷芽胞杆菌， 该菌株已于2015年3月6日送至中国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO :M2015087,分类命名：死亡谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis)NBIF-001，地址：中国 武汉武汉大学。
[0010] 生物学特性：该菌株在LB琼脂平板上繁殖生长形成的菌落圆形，边缘有褶状突 起，乳白色，直径3~5mm，通过镜检观察，细胞形态呈杆状。生理生化鉴定结果如下表1所 示：
[0011] 表1死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株生理生化鉴定
[0016] 死亡谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis)NBIF_001的发酵方法：将死亡谷芽 胞杆菌（Bacillus vallismortis) NBIF-001种子液按L 5%的接种量转接至200L发酵罐 中，发酵培养基为NT培养基，进行发酵罐大量发酵。发酵条件：30°C，溶氧量4m3/h，通气量 1: 0· 75，转速 200rpm，pH7. 0，发酵 36h。
[0017] 死亡谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis)NBIF-001的应用，包括在制备防治西 瓜枯萎病药物中的应用，包括利用该菌株的菌液对西瓜进行灌根或蘸根处理，即可达到防 治西瓜枯萎病的作用；或与其他生防菌混合，制备成混合菌剂，用于防治西瓜枯萎病；包括 在制备番茄枯萎病菌、番茄早疫病菌、禾谷镰刀菌、小麦赤霉病菌或水稻纹枯病菌抑制剂中 的应用；还包括在制备防治黄瓜灰霉病药物、或防治水稻纹枯病药物中的应用；还包括在 制备抑螨药物中的应用。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0019] 1.本发明提供的是一种从植物根际土壤中筛选获得对西瓜枯萎病具有拮抗作用 的生防细菌菌株，低浓度下能够有效抑制西瓜枯萎病菌的生长，对西瓜枯萎病的防治具有 重要意义。
[0020] 2.利用本发明的死亡谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis)NBIF-001 (10亿个/ ml)对西瓜进行灌根处理后，防效高达88. 5%，进行蘸根处理后，其防效也达到了 65.7%， 因此是一株对西瓜枯萎病病原菌具备特异性效果的生防菌。
[0021] 3.本发明提供的死亡谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis)NBIF_001同时对番 茄枯萎病菌、番茄早疫病菌、禾谷镰刀菌、小麦赤霉病菌或水稻纹枯病菌均有抑制作用。同 时对黄瓜灰霉病和水稻纹枯病具有良好的防效，可与其他化学抑菌剂联合施用，以减少化 学抑菌剂对环境的影响。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明的死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株的形态图。
[0023] A :死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株的菌落形态图；B :死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌 株的显微镜观察图。
[0024] 图2是本发明的死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株对西瓜枯萎病菌的抑制效果图。
[0025] 图3是本发明的死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株及3种芽胞杆菌菌株对西瓜枯萎 病菌的抑制效果图。
[0026] 其中：图3中A :死亡谷芽胞杆菌NBIF-001 (10亿个/ml);图3中B :多粘芽胞杆菌 (10亿个/ml);图3中C :地衣芽胞杆菌（10亿个/ml);图3中D :枯草芽胞杆菌（10亿个/ m 1) 〇
[0027] 图4是本发明的死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株对西瓜枯萎病的盆栽灌根防治效 果图。
[0028] 其中：图4中A :接种了西瓜枯萎病菌且仅用培养基灌根的西瓜苗对照；图4中B : 接种了西瓜枯萎病菌且用NBIF-001菌株发酵液灌根的西瓜苗。
[0029] 图5是本发明的死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株对西瓜枯萎病的盆栽蘸根防治效 果图。
[0030] 其中：图5中A :接种了西瓜枯萎病菌且仅用培养基蘸根的西瓜苗对照；图5中B : 接种了西瓜枯萎病菌且用NBIF-001菌株发酵液蘸根的西瓜苗。图5中C :接种了西瓜枯萎 病菌且用地衣芽胞杆菌菌株发酵液蘸根的西瓜苗。图5中D :接种了西瓜枯萎病菌且用多 粘芽胞杆菌菌株发酵液蘸根的西瓜苗。图5中E :接种了西瓜枯萎病菌且用枯草芽胞杆菌 菌株发酵液蘸根的西瓜苗。图5中F :接种了西瓜枯萎病菌且用咪鲜胺溶液（500ppm)蘸根 的西瓜苗。图6是本发明的死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株对番茄枯萎病菌的抑制效果图。
[0031] 图7是本发明的死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株对黄瓜灰霉病的离体叶片防治效 果图。
[0032] 图8是本发明的死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株对水稻纹枯病的离体叶片防治效 果图。 具体实施方案
[0033] 本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或 菌剂，如未特别说明，均为本领域公知或来源于商业渠道。
[0034] 实施例1 :
[0035] 死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株的分离与培养
[0036] 1.细菌的分离与保存
[0037] 将采自云南香格里拉的土壤样品，进行细菌分离培养与保存。
[0038] 具体方法是：称取0.1 g 土样，分别加入灭菌去离子水至总体积为10ml，混匀后放 于70°C水浴锅中加热30min，再依次取Iml继续稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，取稀 释后的菌液2ml涂布LB (配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉20g，补充水分1L， pH 7. 2，121°C灭菌30min)平板，30°C培养过夜。
[0039] 分别挑取单菌落，转接入5ml LB液体培