一种兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多 克隆抗体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋 巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地 就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产 生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激 机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。多克隆抗体是由异源抗原（大分子抗原、 半抗原偶联物）刺激机体产生免疫反应，有机体浆细胞分泌的一组免疫球蛋白。多克隆抗 体由于其可识别多个抗原表位、可引起沉淀反应，制备时间短，成本低的原因广泛应用于研 究和诊断方面。
[0003] 而泛素-蛋白酶体途径广泛存在于真核生物中，是细胞内蛋白质选择性降解的重 要途径，并且在维持细胞功能以及细胞周期运转，抵御环境胁迫，胚胎发育，激素响应和衰 老等方面发挥着重要的作用。泛素-蛋白酶体途径中关键酶主要包括泛素活化酶（El)、泛 素结合酶（E2)与泛素连接酶（E3)，其中泛素结合酶（E2)蛋白在调控光形态建成、维管束发 育、胁迫响应和抗逆胁迫响应等方面具有重要作用。
[0004] 在萌芦科植物领域内，泛素结合酶（E2)基因的研究尚未见报道，泛素结合酶（E2) 基因以多拷贝基因的形式存在，进而造成泛素结合酶（E2)蛋白功能冗余，这是致使泛素结 合酶（E2)基因的研究进展不大的主要原因。随着新一代测序技术的成熟，越来越多模式植 物的全基因组序列被完成，可以利用不同的模式植物来研究基因的功能，并基于其基因组 的差异来解决泛素结合酶（E2)功能容余性的问题，以推动泛素结合酶（E2)蛋白的功能研 究。
[0005] 多克隆抗体技术是研究蛋白质功能和临床检测中重要的一环，但是目前现有技术 中，关于黄瓜泛素结合酶（E2)基因的研究尚未成熟，对于黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆 抗体也没有出现相关报道，更没有出现过关于黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的具 体制备方法，这些都限制了对黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白生物学功能的深入分析，缺少了基 于黄瓜矮化植株检测、品种纯度和分子生物学研究的物质基础和技术支撑。
[0006] 为填补现有技术关于黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的空白，本发明提供 了一种兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体及其制备方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种特异性好、纯度高、可与黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白发 生特异性结合反应的兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体及其制备方法。
[0008] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] -种用于制备兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的黄瓜泛素结合酶CsE2 蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 本发明提供了一种兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体，是以氨基酸序列 如SEQ ID NO: 1所示的黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白作为免疫原，由兔子产生的多克隆抗体。
[0011] 本发明另一方面还提供了一种兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的制备 方法，包括如下步骤：
[0012] 步骤1将粗提取的抗原黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白进行纯化；
[0013] 步骤2从兔子耳部静脉抽取血清，作为阴性对照组血清；
[0014] 步骤3将纯化后的黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白乳化，乳化后在兔子背部皮下多点注 射，先后注射四次，每次间隔7-10天；
[0015] 步骤4第四次注射10-12天后从兔子颈部动脉取血，将所得血样置于离心机中进 行离心，收取离心后血清；
[0016] 步骤5将如氨基酸序列SEQ ID NO: 1所示的黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白与溴化氰 活化的Sepharose 4B偶联，形成多肽亲和层析柱；
[0017] 步骤6将步骤4中含有兔抗黄瓜CsE2蛋白抗体的血清加入到步骤5制备的多肽 亲和层析柱中，放置于4°C孵育过夜后，洗脱抗体，即得到兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多 克隆抗体。
[0018] 进一步地，步骤1中所述黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白的纯化具体为，采用Protein G 亲和柱对粗提取的抗原黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白进行纯化，使黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白 的纯度到达95%以上。
[0019] 进一步地，步骤4中离心的步骤具体为，将所得血样置于离心机中，在5000RPM下 离心两次，每次离心10min。
[0020] 进一步地，步骤5中所述黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的效价在1 : 102400 以上。
[0021] 进一步优选地，所述黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的效价通过ELISA法进 行测定。
[0022] 本发明的兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的制备后的应用较为广泛， 可与黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白发生特异性结合反应，可用于western-blot、免疫组化试验 的要求。
[0023] 本发明的有益效果如下：
[0024] 本发明制备的兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体具有特异性好、纯度高 的特点，可与细胞内源性的黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白发生特异性结合反应，可用于免疫组 化、免疫印迹等实验的要求，用于建立体外免疫分析。本发明的兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2 蛋白多克隆抗体的制备，为深入研究黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白的生物学功能和黄瓜植株 矮化鉴定提供了一个重要的工具，具有重要的理论意义和实际应用价值。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明的兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体效价测定的结果图；
[0026] 图2为本发明的免疫杂交检测兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的特异 性结果图；
[0027] 图3为本发明的兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的结构图。
【具体实施方式】
[0028] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明 的【具体实施方式】做详细的说明。
[0029] 实施例1
[0030] 本发明实施例的一种用于制备兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的黄瓜 泛素结合酶CsE2蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0031] 本发明的实施例提供了一种兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体，是以氨 基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白作为免疫原，由兔子产生的多克 隆抗体。兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体的结构具体如图3所示。
[0032] 本发明的实施例另一方面还提供了一种兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗 体的制备方法，包括如下步骤：
[0033] 步骤1将粗提取的抗原黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白进行纯化；
[0034] 步骤2从兔子耳部静脉抽取血清，作为阴性对照组血清；
[0035] 步骤3将纯化后的黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白乳化，乳化后在兔子背部皮下多点注 射，先后注射四次，每次间隔7-10天；
[0036] 步骤4第四次注射10-12天后从兔子颈部动脉取血，将所得血样置于离心机中进 行离心，收取离心后血清；
[0037] 步骤5将如氨基酸序列SEQ ID NO: 1所示的黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白与溴化氰 活化的Sepharose 4B偶联，形成多肽亲和层析柱；
[0038] 步骤6将步骤4中含有兔抗黄瓜CsE2蛋白抗体的血清加入到步骤5制备的多肽 亲和层析柱中，放置于4°C孵育过夜后，洗脱抗体，即得到兔抗黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多 克隆抗体。
[0039] 具体地，步骤1中所述黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白的纯化具体为，采用Protein G 亲和柱对粗提取的抗原黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白进行纯化，使黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白 的纯度到达95%以上。
[0040] 步骤4中离心的步骤具体为，将所得血样置于离心机中，在5000RPM下离心两次， 每次离心10min。
[0041 ] 步骤6中的黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白多克隆抗体通过ELISA法测定的效价在1 : 102400 以上。
[0042] 实施例2
[0043] 一、抗原蛋白的纯化及纯度分析
[0044] 采用黄瓜茎尖对黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白进行提取，然后通过纯化与双向电泳 获得抗原蛋白的粗品，然后抗原蛋白粗品采用GE公司Protein G亲和柱（HiTrap Protein G HP 17-0404-01)进行纯化及纯度分析，使得黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白的纯度达到95. 8%。
[0045] 二、实验动物的免疫
[0046] 选取健康雄性家兔一只，从兔子耳部静脉抽取阴性血清，作为对照组血清。选取步 骤一中提纯后的黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白200 μ g，用200 μ L生理盐水将其溶解稀释，加入 等体积的弗氏佐剂将黄瓜泛素结合酶CsE2蛋白乳化（初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫 用弗氏不完全佐剂）；用混匀仪器将溶液和佐剂混匀形成油包水，将混匀好的免疫原在兔 子背部皮下多点注射进行免疫，打8-10个点，先后注射四次，每次间隔7天。
[0047] 耳静脉取阴性血：用体积分数为75%的酒精擦拭兔子耳部静脉，擦至静脉充分扩 张，用注射器插入静脉抽取阴性血l_2mL，将所得血样在室温静置30min后，置于离心机中， 在4°C下，5000RPM离心两次，每次离心10min，然后收取血清。颈动脉取阳性血：首先用麻醉 剂麻醉兔子（戊巴比妥钠，30mg/kg，静脉、腹腔、肌肉注射均可），在兔子麻醉后，用固定架 固定，然后用手术器械剪开颈部外层皮毛，于气管侧面下方找到颈动脉，止血钳夹紧动脉管 并剪断放血并收集，将所得血样在室温静置30min后，置于离心机中，在4°C下，5000RPM下 离心两次，每次离心10min，然后收取血清。
[0048] 三、多克隆抗体的纯化
[0049] 多肽亲和层析柱的制备：取Ig CNBr活化的Sepharose 4B琼脂糖凝胶珠，用 lmmol/L HCl 进行预处理后，再用偶联缓冲液（0. lmol/L NaHC03,0. 5m