cramble)的鼻咽癌细胞，在Transwell小室下层加 入含20 %胎牛血清的培养基。细胞继续培养36小时后，用4 %多聚甲醛固定液固定，结晶 紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迀移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的 鼻咽癌细胞。
[0237] 1. 4细胞划痕实验
[0238] 细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迀移能力的实验方法。转染了 AFAPl-ASlshRNA干 扰载体或对照载体（scramble)的鼻咽癌细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90%时，用 200ul pipet在每个6孔板中划一条直线（划痕），随后在0、8、12、16、24、32、48小时等各 个时间点（视不同细胞迀移能力而定）在显微镜下观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细 胞迀移速度。
[0239] 2.结果
[0240] 2. 1在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1后，细胞侵袭能力 降低
[0241] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向 AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著 减少，表明细胞侵袭能力降低（图5)。
[0242] 2. 2在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞迀移 能力降低
[0243] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向AFAP1-AS1的 干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移的速度减慢， 划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低（图6)。
[0244] 实施例5,裸鼠转移瘤模型证实抑制AFAP1-AS1的表达可以抑制鼻咽癌细胞的转 移能力
[0245] 1.材料与方法
[0246] 16只雄性BALB/C裸鼠，4周龄，重量为19±2g，购买于上海斯莱克实验动物有限 公司。所有裸鼠均质检合格，在中南大学实验动物部于无特定病原体（SPF)条件下饲养。 AFAP1-AS1干扰载体构建及多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒的制备、细胞培养与转染等同实 施例4。转染AFAP1-AS1干扰载体或scramble载体（NC)的5-8F细胞各取I X IO6个，经尾 静脉注入裸鼠体内（8只每组），10周后处死裸鼠，观察鼻咽癌细胞的转移情况（主要转移 到裸鼠肺中）。
[0247] 2.结果
[0248] 动物实验进一步证实干扰AFAP1-AS1的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移能力（图 7)。与对照组（NC)相比，敲低AFAP1-AS1的5-8F细胞肺转移灶的数目（图7A-C，P〈0. 05) 变少，转移灶的体积变小（图7D)，表明鼻咽癌细胞的转移能力受到明显抑制。
【主权项】
1. 长链非编码RNA AFAP1-AS1的应用方法，其特征在于，根据该长链非编码RNA基因 制备了用于干扰其表达，并抑制鼻咽癌细胞侵袭转移的制剂；该长链非编码RNA AFAP1-AS1 的序列如SEQ NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的制剂是针对该长链非编码RNA 基因设计的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体。3. 根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，将所述的表达载体负载到多聚赖氨 酸修饰的娃纳米颗粒上制成纳米球。4. 根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，所述的制备用于RNA干扰的短发夹 RNA表达载体所需的3条干扰靶点序列如下： shRNA-1 ：GCAATTCACTGAGTGGTTACG shRNA-2 ：GCTTACTCTCTTGGTGATTCT shRNA-3 ：GCAAGACATCCGATGGTATAC〇5. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于， 针对3条干扰靶点序列，以及载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互 补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点粘性末端的DNA双链；具体序列 如下： shRNA-1 ： 5'-GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGMTTGC TTTTTA-3， 3'-GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAMATTCGA-5， shRNA-2 ： 5'-GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA-3， 3'-GGG CGAATGAGAGMCCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAMATTCGA-5， shRNA-3 ： 5'-GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA-3， 3? -GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAAAATTCGA-5'。6. 根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，所述的用于RNA干扰的短发夹RNA表 达载体的制备方法具体如下： 1. shRNA的设计 首先根据长链非编码RNA基因AFAP1-AS1，寻找shRNA靶点，3条靶点序列如下： shRNA-1 ：GCAATTCACTGAGTGGTTACG shRNA-2 ：GCTTACTCTCTTGGTGATTCT shRNA-3 ：GCAAGACATCCGATGGTATAC 以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列 如下： Scramble ：GACACGCGACTTGTACCAC 2) 针对这3条祀点序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER载体，设计 可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制 性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链；具体需合成的各条寡核苷酸序列及它 们配对退回后形成的DNA双链如下： shRNA-1 ： 5'-GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGMTTGC TTTTTA-3， 3'-GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAMATTCGA-5， shRNA-2 ： 5'-GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA-3， 3'-GGG CGAATGAGAGMCCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAMATTCGA-5， shRNA-3 ： 5'-GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA-3， 3'-GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAMATTCGA-5' Scramble 5? -GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3， 3' -GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5' 3. shRNA载体构建 化学合成上述3个shRNA和对照的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20 yM，互补单链各取10 y 1混合；然后将oligo混合物在PCR仪 中95°C加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段； 用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3. Ikb的载体片段，将退火后的粘性 末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质的量的比例混合，用T4连接酶，16°C连接过 夜；转化E. coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用Cla I和EcoR I酶切 构建好的pSUPER质粒，2%的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入了 目的片段的阳性克隆，将得到的包含AFAP1-AS1干扰序列的pcSUPER质粒转化感受态大肠 杆菌，以扩增质粒。7. 根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于， 多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒是运用0P-10、环己烷、氨水的微乳液自组装技术进行硅 纳米颗粒的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表面修饰， 制备得到。8. 根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒： 1) 将0P-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯，继续搅拌至聚合完 成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80°C干燥，研细得 粒径范围10-50nm的硅纳米颗粒；其中H 2O与0P-10及H2O与正硅酸异酯的摩尔比为2~ 10、氨水浓度为1. 6~28%、正娃酸异酯在环己烧中的摩尔浓度为0. 1~3mol/L ; 2) 将娃纳米颗粒按0. 1~10mg/ml重悬于0. 6M NaCOl^液中，超声分散;，离心，弃上 清，再将沉淀物按0. 1~lOmg/ml重悬于pH 7. 4的PBS中，超声分散，加多聚赖氨酸，终浓 度为4~15nmol/mL，充分混勾，室温混摇；离心，弃上清，沉淀按0. 1~lOmg/ml重悬于双 蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。9. 根据权利要求7或8所述的应用方法，其特征在于，将多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒 超声分散，每毫升纳米颗粒悬液加入10~50ug长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰载体，混 合，室温静置使其结合。
【专利摘要】本发明公开了一种长链非编码RNAAFAP1-AS1基因的应用方法，具体是该长链非编码RNA基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法；根据该基因序列，设计并合成了用于RNA干扰封闭该长链非编码RNA表达的短发夹结构RNA真核表达载体，并将该载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球，利用该载体成功地在鼻咽癌细胞系中抑制了AFAP1-AS1的表达，并抑制了鼻咽癌细胞的侵袭与转移。本发明的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒，可保护AFAP1-AS1干扰载体免受核酸酶降解，延长作用时间，有更高的转染效率，有利于进一步的开发和应用。
【IPC分类】A61P35/00, C12N15/113, A61K48/00, C12N15/63
【公开号】CN105018498
【申请号】CN201510512545
【发明人】曾朝阳, 孛昊, 李桂源, 熊炜, 李小玲, 李夏雨, 邓昊, 龚朝建, 张文玲, 曾勇, 向娟娟, 李征
【申请人】中南大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月20日