一种玉米秸秆发酵制备l-苹果酸以及米根霉菌突变株-2的选育方法
【专利说明】
的选育方法一、
技术领域
[0001]本发明涉及农作物秸杆的综合利用，确切地说是玉米秸杆发酵制备L-苹果酸以及发酵菌株米根霉菌突变株-2的选育方法。
二、【背景技术】
[0002]苹果酸化学名称为2-羟基-1.4- 丁二酸，由于连接羟基的碳原子为不对称碳原子，导致在旋光性上表现为右旋(D-)、左旋(L-)和外消旋(DL-)。因为苹果酸的手性结构，故常以三种形式存在，包括D-苹果酸、L-苹果酸、DL-苹果酸。在果实中最常见的是L型，呈现白色结晶或粉末，有特殊的酸味。
[0003]L-苹果酸是一种重要的有机酸，广泛运用于食品和化学等领域。与柠檬酸相比，苹果酸酸度大、产热低，味道柔和、持久且具特殊香味，被誉为“最理想的食品酸味剂”。
[0004]传统的L-苹果酸发酵是以葡萄糖或者淀粉类为原料，若能利用农作物水解液发酵产L-苹果酸，将扩大原料来源，有效降低成本。在我国生物质纤维素原料丰富，但利用率低，一般采取焚烧填埋等方式处理，不仅浪费资源也对生态环境造成了破坏。有关利用生物质纤维素生产生物乙醇、生物柴油等研究报道很多，但利用生物质纤维素生产有机酸尤其是L-苹果酸的报道较少。如何利用玉米秸杆水解液发酵产L-苹果酸具有深远的意义。
[0005]自然界中产L-苹果酸的菌有米根霉、黄曲霉、寄生曲霉、华根霉等，其中米根霉产L-苹果酸具有营养要求简单、好氧发酵、产物纯度高等特点而被广泛使用。对于微生物菌株进行诱变处理可在短时间内筛选出合适的菌株，积累对人类有益的某一种或几种代谢产物，同时减少副产物的生成，最终将筛选得到的高产、优质菌种推广应用，目前所运用的诱变方法主要包括紫外照射诱变，电离辐射诱变，离子注入诱变，航天育种，复合诱变等。
[0006]60Co属于电离辐射诱变，因其具有高能量，可以通过电离作用直接或间接改变DNA结构，从而达到诱变目的。利用6°Co辐射结合丙烯醇平板筛选乙醇脱氢酶缺陷型菌株，阻断了乙醇代谢，降低副产物乙醇生成。利用6°Co辐射结合氟乙酸平板筛选乙醛酸循环缺陷型菌株，降低了副产物富马酸及琥珀酸的产量。
[0007]在目前的L-苹果酸生产过程中，多以葡萄糖、淀粉等作为发酵碳源，原料成本高。发酵过程中伴随乙醇、富马酸、琥珀酸等副产物的生成，且采用分批发酵，发酵周期长，连续性弱。
三、
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于利用玉米秸杆制备L-苹果酸，所要解决的技术问题利用生物发酵的方法以及选育一株产量高且副产物少的米根霉菌优良的突变菌株。
[0009]本发明利用玉米秸杆发酵制备L-苹果酸的方法，包括液体培养基的配制、灭菌、接种、发酵培养和分离，与现有技术的区别是所述的液体培养基是以浓度为85-115g/L的玉米秸杆水解液作为培养基的基材，也作为碳源，同时添加氮源、无机盐和中和剂，具体为在IL水解液中添加硫酸铵3.5?4.5g/L、硫酸镁0.25?0.35g/L、硫酸亚铁0.020?0.030g/L、磷酸二氢钾0.45?0.55g/L、硫酸锌0.05?0.15g/L、碳酸钙70?90g/L ;培养基灭菌后接种米根霉菌突变株_2，孢子浓度为16?10 sCFU/mL、接种量为发酵液的8?12vt% (体积百分比，下同)，所述的发酵培养是在发酵罐中于31?33°C、通气量(空气)0.35?0.45L/L.min条件下搅拌发酵70?75小时，发酵后固液分离；发酵液米用碱性离子交换树脂D301进行吸附分离，pH为3?4，温度20?30°C，水洗脱，得L-苹果酸水溶液，对其进行定性分析，结果如图2所示。
[0010]优选液体培养基浓度:玉米秸杆水解液100g/L，硫酸铵0.40g/L，硫酸镁0.30g/L，硫酸亚铁0.025g/L，磷酸二氢钾0.50g/L，硫酸锌0.10g/L，碳酸钙80g/L。
[0011]优选孢子浓度107CFU/mL，接种量1vt % (体积百分比)。
[0012]所述的玉米秸杆水解液是玉米秸杆粉碎过40目筛，加入I?2倍量(以质量计，下同)的水于球磨机中湿球磨I?2h ;然后转入水解釜中，再加5?6倍量的水，并用硫酸溶液调pH值2?3，于110?130°C搅拌水解I?1.5小时，水解后用氨水调pH值4.5?5.5，固液分离；滤液浓缩至浓度85?115g/L，即是玉米秸杆水解液。
[0013]所述的米根霉菌突变菌株是这样选育的:
[0014]1.利用同位素6°Co对出发菌株米根霉菌(Rhizopus oryzae CICC41160)进行诱变，诱变剂量10?30Gy，辐照时间为20min。
[0015]2.60Co诱变结合丙烯醇平板筛选得突变株-1，丙烯醇浓度在6ml/L时出发菌株出现显著性抑制，故在丙烯醇浓度6ml/L时筛选出了突变株-1，用于后续诱变。
[0016]3.以上步诱变得到的突变株-1为亲本菌株，通过6°Co(10?30Gy，20min)诱变结合氟乙酸平板筛选得突变株-2 (突变菌株)。选取氟乙酸浓度为7g/L，挑取在此浓度上生长的缺陷型突变株，该菌株即为突变株_2，作为本发明的发酵菌株，用作后续发酵。(具体机制见图3突变菌株选育的内部机制图)。
[0017]4.取步骤3所得发酵突变菌株孢子悬液单独培养48h用于发酵，孢子浓度16?
10sCFU/mLo
[0018]相比与现有技术，本发明具有以下有益效果:
[0019]本发明中所采用的米根霉菌Rhizopus oryzae CICC41160突变菌株是通过同位素6°Co辐照诱变结合丙烯醇平板和氟乙酸平板筛选的乙醇脱氢酶和乙醛酸循环缺陷型菌株。突变株-2能够很好利用玉米秸杆水解液发酵产L-苹果酸，且富马酸、琥珀酸、乙醇含量有明显下降。突变株-2与初始菌株相比，L-苹果酸产量增加了 51.76%，富马酸产量减少了90.12%，琥珀酸产量减少了 81.34%，乙醇产量为O。以玉米秸杆计，L-苹果酸的产率3%，仅次于葡萄糖。
四、【附图说明】
[0020]图1为本发明制备L-苹果酸的工艺流程图。
[0021]图2为L-苹果酸的定性分析图谱，A为标准品图谱，B为样品图谱。
[0022]图3为突变菌株选育的内部机制图。
[0023]图4为不同碳源为原料发酵产L-苹果酸结果比较。五、
【具体实施方式】
[0024](一 )、米根霉菌突变株-2的选育
[0025]1.菌株诱变筛选:利用同位素6°Co对出发菌株Rhizopus oryzae CICC41160进行诱变，诱变剂量10?30Gy，辐照时间为20min。辐射结合丙烯醇浓度为6ml/L平板筛选得突变株-1。将突变株-1再次6°Co辐照(10?30Gy，20min)后接种于氟乙酸质量浓度7g/L的平板上筛选得突变株_2，该菌株即为突变菌株，用于后续发酵。
[0026]2.突变菌株活化培养:将突变菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)中32°C培养l-2d，挑取菌落稠密、菌丝生