一种培养裂殖壶菌高产dha的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵领域，涉及DHA的生产，具体涉及一种培养裂殖壶菌高产 DHA的方法。
【背景技术】
[0002] 二十二碳六稀酸（22:6n_3, docosahexaenoic acid, DHA)是一种重要的 ω-3 系列 多不饱和脂肪酸（co-3polyunsaturated fatty acids)，其既能够促进婴幼儿智力和视力 发育，又具有预防老年人心血管疾病、抗癌、抗炎、增强免疫力等功效。传统的提取多不饱和 脂肪酸的方法是从深海鱼油获取，随着环境污染以及海洋渔业资源的逐渐匮乏，从深海鱼 中提取不饱和脂肪酸显露出存诸多问题，例如品质不稳定、外源性污染、气味不良、纯化成 本高等，鱼油中含有的EPA和胆固醇也使其不适于添加入孕婴食品中。相反，随着微生物发 酵技术的不断成熟，以及微生物发酵油脂技术的深入研究，从微生物中获取油脂不但容易 实现大规模生产，而且还可以克服了传统鱼油普遍存在受地域和气候条件制约的问题，应 用前景非常广阔。
[0003] 裂殖壶菌（Schizochytrium)是目前工业化生产DHA的理想物种之一，其属于破囊 壶菌科的一类海洋微藻，通过高密度发酵培养，其体内可积累大量脂肪，且70%以甘油三酯 形式存在，其中DHA可以占到总脂肪酸的45~55%。
[0004] 裂殖壶菌属于异养型微生物，葡萄糖、果糖和甘油是裂殖壶菌发酵生产DHA的良 好碳源，其中葡萄糖为最适碳源。传统工业化生产藻油DHA主要用葡萄糖作为碳源，但是生 产1吨DHA油脂大约需要消耗5吨葡萄糖，这种转化是低效率的，加之生产过程中需输入大 量能量，设备投资与维护费用不菲，使得当前藻油DHA的生产成本非常高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种培养裂殖壶菌高产DHA 的方法。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] -种培养裂殖壶菌高产DHA的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)将裂殖壶菌菌种接种至装有培养基的摇瓶中，于25~35°C摇床中以150~ 250rpm转速进行恒温恒转速培养20~35h。
[0009] (2)将步骤（1)得到的种子液转接到装有培养基的摇瓶中，接种体积为培养基装 液量的5~10%，于25~30°C、150~250rpm条件下进行恒温恒转速培养16~20h，测 量所得种子液的细胞干重，若得到的种子液中细胞干重达到18~22g/L，则直接进行步骤 ⑷。
[0010] (3)若步骤⑵得到的种子液中细胞干重没达到18~22g/L，则将其进一步转接 到装有培养基的摇瓶中，按照步骤（2)中的方法进行培养；重复该步骤一次或多次至培养 得到的种子液中细胞干重达到18~22g/L。
[0011] (4)将上述细胞干重达到18~22g/L的种子液以5~10% (V/V)的接种量接种 到装有培养基的种子罐中进行发酵培养；通过氨水或液碱控制发酵过程PH值维持在5. 5~ 6. 5之间，培养温度控制在25~35°C，通气量控制在0. 3~0. 5vvm，培养至发酵液中葡萄糖 耗尽，停止培养；
[0012] (5)将步骤（4)种子罐中的发酵液以5~10%的接种量接种到装有培养基的发 酵罐中进行发酵培养；培养温度控制在22~33°C，通气量控制在0. 3~0. 5vvm，通过流加 葡萄糖溶液控制发酵液中葡萄糖浓度维持在30~50g/L，通过流加混合氮源溶液控制发酵 过程中总氮的浓度维持在15~25g/L，该混合氮源中包含酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸 钠、蛋白胨中的一种或多种；通过流加氨水或液碱控制发酵过程pH维持在5. 5~6. 5 ;发酵 培养至70~IOOh后进行低温胁迫培养，将温度降低为18~22°C，其余条件不变，继续培养 30 ~50h〇
[0013] 上述步骤（1)、（2)和（3)中的培养基的配方为：葡萄糖40~50g/L、酵母抽提物 10~25g/L、硫酸钠5. 0~10.0 g/L、氯化钾0. 6~0. 8g/L、硫酸镁1. 8~2. 2g/L、磷酸二 氢钾1. 9~2. lg/L、氯化钙0. 14~0. 16g/L、硫酸铵0. 8~I. 2g/L、四水氯化锰1. 68~ I. 72mg/L、七水硫酸锌2. 8~3. Omg/L、五水硫酸铜L 4~I. 6mg/L、二水钼酸钠0~0· 05mg/ L、六水氯化钴0~0· 05mg/L。
[0014] 上述步骤（4)和（5)中的培养基的配方为：葡萄糖75. 0~85. Og/L、玉米浆干粉 15~20g/L、酵母抽提物2. 9~3. lg/L、谷氨酸钠5. 0~15. Og/L、硫酸钠5. 0~10.0 g/ U氯化钾0. 6~0. 8g/L、硫酸镁1. 8~2. 2g/L、磷酸二氢钾1. 9~2. lg/L、氯化钙0. 14~ 0· 16g/L、硫酸铵(λ 8~L 2g/L、四水氯化锰L 68~L 72mg/L、七水硫酸锌2. 8~3. Omg/L、 五水硫酸铜1. 4~I. 6mg/L、二水钼酸钠0~0· 05mg/L、六水氯化钴0~0· 05mg/L。
[0015] 步骤（1)中所述的裂殖壶菌菌种优选为裂殖壶菌ATCC20888。更优选的，步骤（1) 为：将用甘油保存的裂殖壶菌ATCC20888菌种接种到装有50mL培养基的250m摇瓶中，于 25~30°C摇床中以150~250rpm转速进行恒温恒转速培养25~35h。
[0016] 步骤⑷和（5)中所述的氨水的浓度优选为28~30% (V/V)，所述的液碱的浓度 优选为30~40% (W/V)。
[0017] 步骤（5)中所述的葡萄糖溶液的浓度优选为700~750g/L，所述的混合氮源溶液 的浓度优选为200~500g/L。
[0018] 步骤⑷中所述的种子罐的体积优选为200L，罐体装液量优选为150L ;步骤（5) 中所述的发酵罐的体积优选为3000L，罐体装液量优选为1500L。
[0019] 本发明通过对裂殖壶菌发酵生产DHA的培养基和培养条件进行优化，釆用传统的 好氧发酵法，在3000L发酵罐发酵前中期采用相对较高温进行高密度培养，发酵后期进行 低温胁迫培养，该培养方法既降低了发酵成本，又降低发酵过程的控制难度，发酵结束后发 酵液的细胞干重达到120~150g/L，DHA达到40~50g/L，比已见报道的DHA生产率高出 1. 2~1. 5倍，非常适合应用于DHA的工业化生产。本发明培养裂殖壶菌高产DHA的方法具 有以下优势：
[0020] (1)采用前中期高温培养，后期短时间的低温胁迫诱导培养，与传统的低温发酵相 比，能耗至少降低30%，大大减少了发酵过程对能量的需求，以及对制冷设备的要求。
[0021] (2)本发明中所用培养基配方相比于传统发酵，生产水平较高，并且成本大幅度降 低，能够在增加收益的同时降低发酵风险。
[0022] (3)通过高密度好氧发酵法培养裂殖壶菌生产DHA等多不饱和脂肪酸（PuFA)可減 少因市场需求过大而导致的大量捕捞带来的环境影响，因此该发明对环境资源的保护具有 潜在的意义，同时通过微生物发酵法生产二十二碳六烯酸等产品，生产过程中产生的三废 较少，工厂的建设和投资成本相对较低。
[0023] (4)尽管目前发现的高密度培养裂殖壶菌发酵生产的脂质含量通常比传统鱼油 低，但微生物发酵生产的油脂含有大量必须脂肪酸，而且通过微生物发酵法获得的脂肪酸 组成比较简单，多不饱和脂肪酸的含量非常高，富集也比从传统鱼油提取容易得多，这种高 纯度对后续提取工艺极为有利，能够简化提纯过程，在工业生产中可以极大地降低生产成 本。
[0024] (5)通过微生物发酵法获得多不饱和脂肪酸的工艺不受季节及气候变化的因素 限制，可以全年进行生产，并且不受原料和产地的限制，增加了多不饱和脂肪酸生产的灵活 性。
[0025] (6)通过微生物发酵法提取得到的油脂不像鱼油制品那样含有较多的胆固醇，增 加了产品的纯度及产品的适用面，使产品的品质更有保证。
[0026] (7)高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA，其菌种裂殖壶菌富含蛋白质、微量元素、 维生素、抗氧化剂等，在膳食配方中可以作为大量营养素和微量营养素的来源。
[0027] (8)通过微生物进行发酵的不仅可以提高产品的质量，而且可以利用基因工程手 段并结合微生物产多不饱和脂肪酸的代谢途径，利用代谢调控的方法来控制PuFA的组成， 从而可以实现产品生产的人工控制。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 [0029] 实施例1
[0030] (1)配制培养基
[0031] 摇瓶培养基的配制方法如下：将配方中的组分四水氯化锰、七水硫酸锌、五水硫酸 铜、二水钼酸钠、六水氯化钴称量后，用无菌水充分溶解，制备成母液，酸性条件下，121°C高 压蒸汽灭菌20min ;其他成分称量之后，用无菌水充分溶解后分装至摇瓶，121°C高压蒸汽 灭菌20min。
[0032] 摇瓶培养基配方如下：葡萄糖45g/L、酵母抽提物10g/L、硫酸钠8. Og/L、氯化钾 0. 7g/L、硫酸镁2. Og/L、磷酸二氢钾2. Og/L、氯化钙0. 15g/L、硫酸铵1.0 g/L、四水氯化锰 1. 7mg/L、七水硫酸锌3. 0mg/L、五水硫酸铜I. 5mg