稳定形式的信号转化蛋白融合蛋白、及其使用和制备的方法
【技术领域】
[0001] 在至少一些实施方式中，本发明设及稳定形式的SCP(信号转化蛋白）融合蛋白， 尤其设及运样的融合蛋白的同源六聚体形式。
【背景技术】
[0002] 目前本领域已知的信号-转化-蛋白（SCP)是双功能融合蛋白，其将I型膜蛋白 的细胞外部分（细胞外氨基-末端）连接至II型膜蛋白的细胞外部分（细胞外簇基-末 端），形成具有两个活性侧的融合蛋白（例如参照美国专利号7, 569, 663)。CTLA4-FasL是 一种SCP，其中N-末端侧由CTLA-4的细胞外结构域组成，CTLA-4是W高亲和性结合B7受 体的I型膜蛋白，并且C-末端侧由化S-配体（FasL)的细胞外结构域组成，Fas-配体是诱 导细胞调亡的II型膜配体。
[0003]CTLA-4 (细胞毒性T-淋己细胞抗原4)也称为CD152,是通过抑制T-细胞的激活 来自然下调免疫系统的蛋白受体。T-细胞激活需要CD28受体与抗原呈递细胞上的CD80和 CD86受体（也分别称为B7-1和B7-2)之间的共刺激结合。CTLA-4的功能与CD28类似，它 们都结合B7,但是，CD28传递积极的T-细胞激活刺激信号，CTLA-4W更高的亲和性结合B7 受体但是不激活T-细胞，因此，与CD28竞争并且下调免疫系统。已知与膜结合的CTLA-4 作为通过二硫键相互连接的同源二聚体起作用。
[0004]CTLA4与B7的强结合亲和力使得设计基于蛋白的疗法，将CTLA4细胞外结 构域连接至已经证实可用于自身免疫性疾病和移植的抗体Fc结构域（CTLA4-FC) (Herrero-BeaumontG，MartinezCalatravaMJ，CastanedaS.Abataceptmechanismof actionconcordancewithitsclinicalprofile.RheumatolClin. 2012Mar_Apr2012; 8(2):78-83)。在运些嵌合构建体中，CTLA4和Fc结构域形成天然同源二聚体（AroraS， TangiralaB，OsadchukL，SureshkumarKK.Belatacept：anewbiologicalagentfor m曰inten曰neeofimmunosuppressioninkidneytr曰nspl曰nt曰tion.ExpertOpinionon Biologicalllierapy. 2012 ; 12(7) : 965-979)。
[000引化sL是II型膜蛋白，其天然结合和激活化s-受体（FasR)，运诱导细胞调亡、或 程序性细胞死亡。化sL和化sR属于肿瘤坏死因子灯NF)家族并且化sL/FasR的相互作用 在免疫系统的调节和癌症的进展中起到重要的作用。FasL与其他TNF超家族成员一样，用 作通过化sR的S聚作用传送信号的非共价键合的同源S聚体蛋白，其通常导致"祀"细胞 的调亡。由于化sL结合和化sR的S聚作用，在祀细胞内形成诱导死亡的信号传导复合物 值ISC)，并且随后诱导细胞调亡。研究指示，两个相邻的S聚体化sL对于有效的化sR信号 传导和DISC的形成是必须的（Holler等，MolecularandCellularBiology,Feb. 2003， 1428 - 1440 页.Eisele等，Neuro-Oncology13 似：155 - 164,2011)。
[0006] 非霍奇金淋己瘤（NHL)作为疾病集合，是十大最普遍的恶性肿瘤之一，占男人和 女人二者中所有恶性肿瘤的约4%。NHL是B或T-淋己细胞系的，它们大部分（80-90% ) 是B-细胞起源的。尽管预后和治疗取决于具体的类型和阶段，已经证实放射和化疗在许多NHL患者中有效。新的基于蛋白（比如抗CD20)的疗法最近已经添加至治疗工具箱。总体 5年存活率已经增加至约50%，但是仍需要新的有效治疗用于更加侵略性和复发形式的疾 病。
[0007] 已知激活的B-细胞表达高水平的B7受体，B7受体也称为CD80化7.^和 CD86化7. 2)。这对于T-细胞激活是必须的，而T-细胞激活是T-细胞CD28受体和包括B 淋己细胞的抗原呈递细胞上B7受体之间的共刺激信号部分的一部分。与激活的B-细胞类 似，B-细胞淋己瘤细胞也表达高水平的B7分子。
[0008] 信号-转化-蛋白（SC巧是一种新型的双功能融合蛋白，其是通过如下形成： 直接连接I型膜蛋白的细胞外结构域（细胞外氨基-末端）至II型膜蛋白的细胞外 结构域（细胞外簇基-末端）从而产生具有两个活性侧的融合蛋白。CTLA4-FasL是一 种这样的SCP，其中N-末端侧是CTLA-4的细胞外结构域并且C-末端侧由Fas-配体 (FasL)的细胞外结构域组成化比H,M.LT.CTLA-4-Fasligandfunctionsasatrans signs!converterproteininbridging过ntigen-presentingcells过ndTcells. InternationalImmunology. 2001 ; 13(4) : 529-539)D因为CTLA4-FasL能够结合至B7 分子 和FasR，并且在该情况下，同时，抑制共刺激和诱导细胞稠亡。已经显示CTLA4-FasL有效诱 导激活的T-细胞的细胞稠亡（OrbachA，RachmilewitzJ，ParnasM，HuangJH，Tykocinski ML,Dranitzki-ElhalelM.CTLA-4.FasLinducesearlyapoptosisofactivated Tcellsbyinterferingwithanti-apoptoticsignals.JImmunol.Dec2007; 179(11) :7287-7294)并且在多发性自身免疫和移植动物模型中用作强有力的免疫调节剂 (ZhangW，Wa打gF，WangB，ZhangJ，YuJY.IntraarticulargenedeliveryofCTLA4-FasL suppressesexperimentalarthritis.IntImmunol.Jun2012 ;24 (6):379-388;JinY，Qu A，WangGM，HaoJ，GaoX，XieS.SimultaneousstimulationofFas-mediatedapoptosis andblockadeofcostimulationpreventautoimmunediabetesinmiceinducedby multiplelow-dosestreptozotocin.GeneTher.Jun2004:11(12) :982_991;ShiW，Qien M，XieL.ProlongationofcornealallograftsurvivalbyCTLA4-FasLinamurine model.GraefesArchClinExpOphthalmol.Nov2007:245(11):1691-1697;FengYG，Jin YZ，ZhangQY，HaoJ，WangGM，XieSS.CTLA4-Fasligandgenetransfermediatedby adenovirusinducelong-timesurvivalofmurinecardiacallografts.Transplant Proc.化n2005 ;37巧）：2379-2381)。最近，本发明人已经表明CTLA4-FasL可通过激活促细 胞调亡信号同时消除抗细胞调亡信号而诱导B细胞淋己瘤细胞系的强力细胞调亡（化bach A，RachmilewitzJ，ShaniN，等CD40 ?FasLandCTLA-4 ?FasLfusionproteinsinduce apoptosisinmalignantcelllinesbydualsignaling.AmJPathol.Dec2010; 177巧）：3159-3168)。
【发明内容】
[0009] 出人意料地，本发明人发现CTLA4-FasL融合蛋白在溶液中作为同源六聚体更稳 定，并且事实上可任选地调整该融合蛋白的纯化和产生过程，从而同源六聚体形式是融合 蛋白的主要形式。此外，运样的融合蛋白的增加的稳定性可延伸至具有如下描述特性的其 他SCP(信号转化蛋白）融合蛋白。
[0010] "CTLA4-FasL融合蛋白"意思是双组分蛋白，其特征在于如本文所描述的共价连接 的CTLA4结构域和化sL结构域。该融合蛋白本文也称为"CTLA4-FasL"。任选地和优选地， 该双组分蛋白包含CTLA-4的细胞外结构域和化S-配体（FasL)的细胞外结构域。任选地 和更优选地，双组分蛋白具有N-末端侧和C-末端侧，N-末端侧是CTLA-4的细胞外结构域， C-末端侧由化S-配体（FasL)的细胞外结构域组成。
[0011]尽管该形式称为同源六聚体，但是其可任选地也描述为约250kD的多聚体。虽然 不希望被单个假设限制，但相信两个不同类型的同源六聚体结构可任选地根据相互作用 (可W是共价的或非共价）而形成。在第一类型中，同源六聚体经两个化sLS聚体的相互 作用进而二聚化而形成。在第二类型中，同源六聚体经S个CTLA4二聚体的相互作用进而 =聚化而形成。当然运些不同类型仅仅作为非限制性例子呈现。
[001引运些发现（CTLA4-FasL融合蛋白在溶液中作为同源六聚体更稳定）是尤其出人意 料的，因为融合蛋白的每个组分的特征在之前都未使得本领域普通技术人员预测运样的结 果。二聚体蛋白比如CTLA-4与S聚体TNF超家族成员比如化sL的融合开创了可形成低聚 体的可能性。例如，共价连接的同源二聚体可通过形成天然、二硫键连接的CTLA-4二聚体 而形成，而同源S聚体可经化sLS聚化的天然必要条件形成。通过使用化学交联和凝胶过 滤分析的研究该问题的一篇文章显示，CTLA4-FasL复合物确实包含分子间二硫键但是表明 S聚体分子化学计量（Huang和Tykocinski，IntImmuno2001，13卷，4期，529-539 页）。 作者表示，因为他们鉴定的主结构是同源=聚体并且溶液中同源六聚体的形成不太可能， 同源六聚体可能在祀细胞的表面上形成，诱导出作者所记录的及其有效的细胞调亡。
[0013]根据本发明的至少一些实施方式，提供了稳定的CTLA4-FasL融合蛋白，其中在溶 液中，大部分融合蛋白为同源六聚体形式。
[0014]根据本发明的至少一些实施方式，提供了产生稳定的CTLA4-FasL融合蛋白的方 法，其中蛋白的特征在于在溶液中，大部分融合蛋白为同源六聚体形式。任选地和优选地， 同源六聚体形式作为初始收获之后、已经对蛋白施加任何纯化方法之前的主要形式存在。
[0015]"初始收获"意思是，例如在已经收获细胞培养基之后，随着蛋白从细胞分泌至细 胞培养基，将细胞从培养基去除（任选地通过例如离屯、或过滤）。优选地进行初始收获的方 法使得同源六聚体形式作为细胞培养基中的主要形式存在。此外，任选地进行纯化方法，W 便维持同源六聚体形式作为纯化期间的主要形式。"主要形式"意思是同源六聚体形式是融 合蛋白的至少51%。除非另外指出，融合蛋白的百分数是相对于总融合蛋白量给出，并且没 有必要相对于总蛋白含量。
[0016]根据至少一些实施方式，同源六聚体形式任选地是总融合蛋白的至少51%，优选 地至少60 %，更优选地至少70 %，最优选地至少80 %，任选地和最优选地至少90 %，也任选 地和最优选地至少95%，96%，直到100% ;任选地运些量之间的任何百分数也可考虑在运 些实施方式中。
[0017]根据至少一些实施方式，同源六聚体形式任选地是纯化之前的主要形式并且优选 地是纯化之后的主要形式。如果同源六聚体形式不是主要形式，那么其至少重要的次要形 式（优选地至少20 %，更优选地至少30 %，最优选地至少40 %，任选地和最优选地50 %;任 选地运些量之间的任何百分数也可考虑在运些实施方式中）。
[0018] 根据至少一些实施方式，存在十二聚体形式，任选地在纯化之前和/或期间和/或 之后存在。任选地，十二聚体形式是纯化期间的主要形式；任选地和优选地，无论十二聚体 形式是否是纯化期间的主要形式，同源六聚体形式是至少纯化之后和任选地纯化之前的主 要形式。尽管该形式称为十二聚体，其也可任选地描述为约500kD的多聚体。
[0019] 根据至少一些实施方式，十二聚体形式任选地不多于总融合蛋白的5%。优选地， 十二聚体形式不多于总融合蛋白的4%。更优选地十二聚体形式不多于总融合蛋白的3%。 最优选地，十二聚体形式不多于总融合蛋白的2%。任选地和最优选地，十二聚体形式不多 于总融合蛋白的1%。
[0020] 根据至少一些实施方式，就十二聚体的量和同源六聚体的量而言，上面的实施方 式被任选地组合。
[0021] 根据至少一些实施方式，提供了主要形式的稳定的同源六聚体SCP(信号转化蛋 白）融合蛋白。如本文所使用，术语"融合蛋白"一般指如下的蛋白：其中N-末端形成同源 二聚体并且具有特定生物功能，W及C-末端侧形成同源S聚体并且不同生物功能。N-末端 称为"组分1蛋白"，而C-末端称为"组分2蛋白"。
[0022] 根据本发明的至少一些实施方式，融合蛋白是I型蛋白和II型蛋白的融合，其中 I型已知形成同源二聚体，II型已知形成同源S聚体。基于本文为CTLA4-FasL融合蛋白提 供的数据，运些融合蛋白应形成同源