:体积百分浓度0.1%三氟乙酸乙腈溶液。流速:200ml/mino检测波长:220nm。梯度:B%:20_60%，90min。进样量为25g。
[0029]纯化过程:将色谱柱用体积百分浓度90%三氟乙酸乙腈溶液冲洗干净后平衡好上样，上样量为25g。梯度洗脱90min，收集纯度大于95%馏分，馏分在不高于37°C条件下减压蒸馈至25mg/ml留作二次使用。
[0030]3.二次纯化
纯化条件:色谱柱:以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，柱子直径和长度为:1cmX 25cm.流动相:A相:体积百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液；B相:体积百分浓度0.1%三氟乙酸乙腈溶液。流速:200ml/min。检测波长:220nm。梯度:B%:30_50%，120min。进样量为15g。
[0031]纯化过程:将色谱柱用体积百分浓度90%三氟乙酸乙腈溶液冲洗干净后平衡好上样，上样量为15g。梯度洗脱120min，收集纯度大于98%馏分，馏分在不高于37°C条件下减压蒸馈至30mg/ml留作换盐使用。
[0032]4.转盐:用体积百分浓度60%以上的去离子水冲洗固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，冲洗至流出液为中性后再以体积百分浓度0.3%的醋酸水溶液和色谱纯甲醇两相溶液平衡色谱柱，待色谱柱平衡彻底后开始上样转盐，上样量为已经收集好的目的肽溶液，线性梯度洗脱:10-60min体积百分浓度90-95%的醋酸水溶液后再60_90min体积百分浓度30-90%的甲醇溶液，收集大于98%的目标峰。
[0033]5.将转盐后所得的溶液，进行减压浓缩至lg/50ml，浓缩温度不超过37°C，然后冷冻干燥得纯度大于98.0%的美拉诺坦II，纯化收率79.1%。
[0034]实施例4
1.样品处理:将美拉诺坦II粗品溶液中加入一定量的醋酸超声搅拌后用孔径为
0.45 μ m滤膜过滤后收集滤液备用。
[0035]2.一次纯化纯化条件:色谱柱:以聚合物为基质的填料色谱柱，孔径为20 μπι，柱子直径和长度为:15CmX25Cm.流动相:A相:体积百分浓度0.05%三氟乙酸水溶液；B相:体积百分浓度
0.05%三氟乙酸乙腈溶液。流速:500ml/mino检测波长:220nm。梯度:B%:20_60%，90min。进样量为25g。
[0036]纯化过程:将色谱柱用体积百分浓度90%三氟乙酸乙腈溶液冲洗干净后平衡好上样，上样量为25g。梯度洗脱90min，收集纯度大于95%馏分，馏分在不高于37°C条件下减压蒸馈至25mg/ml留作二次使用。
[0037]3.二次纯化
纯化条件:色谱柱:以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，柱子直径和长度为:15cmX25cm.流动相:A相:体积百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液；B相:体积百分浓度0.1%三氟乙酸乙腈溶液。流速:500ml/min。检测波长:220nm。梯度:B%:30_50%，120min。进样量为15g。
[0038]纯化过程:将色谱柱用体积百分浓度90%三氟乙酸乙腈溶液冲洗干净后平衡好上样，上样量为15g。梯度洗脱120min，收集纯度大于98%馏分，馏分在不高于37°C条件下减压蒸馈至30mg/ml留作换盐使用。
[0039]4.转盐:用体积百分浓度60%以上的去离子水冲洗固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，冲洗至流出液为中性后再以体积百分浓度0.2%的醋酸水溶液和色谱纯甲醇两相溶液平衡色谱柱，待色谱柱平衡彻底后开始上样转盐，上样量为已经收集好的目的肽溶液，线性梯度洗脱:10-60min体积百分浓度90-95%的醋酸水溶液后再60_90min体积百分浓度30-90%的甲醇溶液，收集大于98%的目标峰。
[0040]5.将转盐后所得的溶液，进行减压浓缩至lg/50ml，浓缩温度不超过37°C，然后冷冻干燥得纯度大于98.0%的美拉诺坦II，纯化收率77.6%。
[0041]实施例5 1.样品处理:将美拉诺坦II粗品溶液中加入一定量的醋酸超声搅拌后用孔径为
0.45 μ m滤膜过滤后收集滤液备用。
[0042]2.一次纯化
纯化条件:色谱柱:以聚合物为基质的填料色谱柱，孔径为30 μ m，柱子直径和长度为:20cmX25cm.流动相:A相:体积百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液；B相:体积百分浓度0.1%三氟乙酸乙腈溶液。流速:800ml/min。检测波长:220nm。梯度:B%:20_60%，lOOmin。进样量为50g。
[0043]纯化过程:将色谱柱用体积百分浓度90%三氟乙酸乙腈溶液冲洗干净后平衡好上样，上样量为50g。梯度洗脱10min，收集纯度大于95%馏分，馏分在不高于37°C条件下减压蒸馈至25mg/ml留作二次使用。
[0044]3.二次纯化
纯化条件:色谱柱:以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，柱子直径和长度为:20cmX25cm.流动相:A相:体积百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液；B相:体积百分浓度0.1%三氟乙酸乙腈溶液。流速:800ml/min。检测波长:220nm。梯度:B%:30_50%，120min。进样量为35g。
[0045]纯化过程:将色谱柱用体积百分浓度90%三氟乙酸乙腈溶液冲洗干净后平衡好上样，上样量为35g。梯度洗脱120min，收集纯度大于98%馏分，馏分在不高于37°C条件下减压蒸馈至30mg/ml留作换盐使用。
[0046]4.转盐:用体积百分浓度60%以上的去离子水冲洗固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，冲洗至流出液为中性后再以体积百分浓度0.2%的醋酸水溶液和色谱纯甲醇两相溶液平衡色谱柱，待色谱柱平衡彻底后开始上样转盐，上样量为已经收集好的肽溶液，线性梯度洗脱:10-60min体积百分浓度90-95%的醋酸水溶液后再60_90min体积百分浓度30-90%的甲醇溶液，收集大于98%的目标峰。
[0047]5.将转盐后所得的溶液，进行减压浓缩至lg/50ml，浓缩温度不超过37°C，然后冷冻干燥得纯度大于98.0%的美拉诺坦II，纯化收率78.8%。
【主权项】
1.一种美拉诺坦II的纯化方法，采用高效液相色谱法，其特征是包括如下步骤: 1)将美拉诺坦II粗品溶液以0.45 μπι滤膜过滤后待用，以聚合物为基质的填料色谱柱，流动相为三氟乙酸水溶液为A相，三氟乙酸乙腈溶液为B相，进行梯度洗脱纯化，收集一次目的峰值的肽溶液； 2)将一次收集的肽溶液以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，流动相:三氟乙酸水溶液为A相，三氟乙酸乙腈溶液为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液； 3)利用HPLC转盐法交换转成醋酸盐； 4)将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品肽。2.根据权利要求1所述纯化美拉诺坦II的方法，其特征在于:所述步骤中流动相A为体积百分浓度0.05-0.1%三氟乙酸水溶液，B为体积百分浓度0.05-0.1%三氟乙酸乙腈溶液。3.根据权利要求1所述纯化美拉诺坦II的方法，其特征在于:所述梯度洗脱纯化，流动相B的一次纯化梯度为20-60%，二次纯化梯度为30-50%，检测波长为220nm。4.根据权利要求1所述纯化美拉诺坦II的方法，其特征在于:所述的HPLC转盐法，流动相为体积百分浓度0.2-0.5%的醋酸水溶液和色谱纯甲醇的两相溶液，色谱柱为十八烷基键合娃胶的反相娃胶柱。
【专利摘要】本发明公开了一种美拉诺坦II的纯化方法，主要解决强碱性导致色谱柱损坏的技术问题。纯化方法包括如下步骤：1）将美拉诺坦II粗品溶液以0.45μm滤膜过滤后待用，以聚合物为基质的填料色谱柱，流动相为三氟乙酸水溶液为A相，三氟乙酸乙腈溶液为B相，进行梯度洗脱纯化，收集一次目的峰值的肽溶液；2）将一次收集的肽溶液以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，流动相：三氟乙酸水溶液为A相，三氟乙酸乙腈溶液为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；3）利用HPLC转盐法交换转成醋酸盐；4）将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品肽。本发明的方法提供了一种美拉诺坦II的纯化方法，纯度好，收率高，又充分保护色谱柱，降低成本，便于工业化实施。
【IPC分类】C07K1/20, C07K1/34, C07K1/14
【公开号】CN105037488
【申请号】CN201510523305
【发明人】徐红岩, 秦敬国
【申请人】南京肽业生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月25日