透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医用材料制备领域，特别涉及一类透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白 生物材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白是生物体内细胞外基质的主要蛋白成分，其特有的三股螺旋肽链结构， 赋予它许多优良性质：韧性弹性好、低免疫原性、生物可降解性、生物相容性、止血性和促进 细胞生长，因此是生物材料及组织工程领域的优选材料。透明质酸多糖（HA)是细胞外基质 中的一种糖胺聚糖，在维持组织的完整性和功能性，调控细胞的粘附、增殖、分化等方面起 着重要作用。由于具有独特的流变学特性、粘弹性、吸湿性以及良好的生物相容性，在生物 材料、组织修复与再生、药物载体等领域有着广泛应用。特别是随着分子量不同，HA具有不 同的抗凝血和促血管化功能。尤其是在促进血管内皮细胞增殖和血管化方面，根据其分子 量不同，HA有着相反的作用。大分子的HA多糖抑制血管内皮细胞增殖、迀移，从而抑制血 管生成；小分子的透明质酸寡糖（〇-HA)，特别是3-10双糖片段，可明显促进血管内皮细胞 的增殖和迀移，从而促进血管的生成。尽管〇-HA具有良好的促血管化功能，但是其本身为 小分子不能作为血管修复材料。因此，如果考虑用〇-HA修饰胶原蛋白，制备一种具有促血 管化功能的新型血管修复材料，有望用于治疗当今严重威胁人类生命的心血管疾病。同时， 其促血管化的功能，作为其它组织修复材料也可以促进再生组织的血管化，有利于组织的 修复与再生。
[0003] West et al. (1985)，Chuang TW et al. (2009)等相继报道了 HA 的 3-10 双糖片段 在刺激血管再生方面的作用。中国专利文件CN1927414A(【申请号】200610076649. 7)公开 了层粘连蛋白通过碳二亚胺盐酸盐?DC)和己二酸二酰肼（ADH)交联HA多糖，制备神经组 织再生修复材料。中国专利文件CN103333349A(【申请号】201310264026. 9)公开了一种注 射用透明质酸_胶原蛋白复合水凝胶及其制备方法，作为软组织填充材料。中国专利文件 CN102836465A(申请号=201210314947. 0)公开了一种注射用丝素蛋白/透明质酸复合凝胶 及其制备与应用。但是，以上材料所用透明质酸都是大分子的HA多糖。目前用于血管及其 它组织修复材料的HA也都是大分子多糖，至少也是在分子量5000Da以上的HA寡聚糖。这 显然不能满足（3-10双糖）o_HA片段更好地促进血管再生的要求。这种局限性是由于o-HA 大量制备比较困难，目前市面仅微量（一般微克，极少数毫克）级别的〇-HA可得到，且价格 昂贵。在组织工程修复材料的制备中，材料需求量大，至少需要克级。因此研究中未见报道 将特定分子量〇-HA(四糖、六糖、八糖、十糖）与胶原蛋白通过化学反应进行连接，制备透明 质酸寡糖修饰的胶原蛋白生物材料。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材 料及其制备方法，以期用于血管及其它组织修复。本发明通过酶法水解和分离纯化，首先成 功制备批量〇-HA(四糖、六糖、八糖和十糖），然后通过交联制备透明质酸寡糖修饰的胶原 蛋白。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] -种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料，是由透明质酸寡糖与胶原蛋白 通过交联反应得到；所述的交联物中，透明质酸寡糖的质量百分比为〇. 2% -5. 1%。
[0007] 根据本发明，优选的，所述的透明质酸寡糖的分子量为397. 33Da_3811. 21Da，进一 步优选的，所述的透明质酸寡糖为透明质酸四糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖或/和透明 质酸十糖。
[0008] 根据本发明，上述透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料的制备方法，包括 步骤如下：
[0009] (1)利用透明质酸酶降解透明质酸或透明质酸钠，分离纯化，冷冻干燥得到透明质 酸寡糖；
[0010] (2)将步骤（1)得到的透明质酸寡糖与胶原蛋白在交联剂作用下进行交联反应， 得到透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料。
[0011] 根据本发明方法，优选的，步骤⑴中所述的透明质酸酶的浓度为 (0. 1-2. 0) X 105U/L，所述的透明质酸或透明质酸钠的质量浓度为（0. 5-2. 0)mol/L，酶解温 度为（25-60) °C，酶解时间为（10-24) h;
[0012] 优选的，步骤（1)中所述的分离纯化方法采用Sephdax LH-20或Bio-gel P-6凝 胶层析柱（规格：1. 6 cm *80 cm )，上样流速为0? 2-1. OmL/min ;上样体积为0? 5-2mL ;流 动相为〇. 05-0. 5mol/L的碳酸氢铵；分离流速为0. 1-0. 5mL/min ;紫外（UV)检测波长为 232nm。采用电喷雾质谱（ESI-MS)测定透明质酸四糖、六糖、八糖和十糖的分子量分别为 776, 1155, 1535和1914,其质谱图谱如图1所示。
[0013] 根据本发明方法，步骤⑵中，优选的，所述的交联剂为1_(3_二甲氨基丙 基）-3_乙基碳二亚胺（EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS);
[0014] 优选的，所述的EDC、NHS和透明质酸寡糖中羧基（oHA-COOH)的摩尔比为 (3. 0-9. 0) : (1. 0-3. 0) :1. 5,进一步优选为 6. 0 :2. 0 :1. 5 ;
[0015] 优选的，所述的透明质酸寡糖与胶原蛋白的质量比为（1-3) :(7-9)，进一步优选 为 2:8 ;
[0016] 优选的，所述的交联反应时间为l_5h，进一步优选为4h ;
[0017] 优选的，所述的交联反应温度为30-40°C，进一步优选为37°C。
[0018] 根据本发明，上述透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料在组织修复材料制备中有 潜在的应用。
[0019] 本发明透明质酸寡糖与胶原蛋白交联的反应机理如下，以EDC/NHS作交联剂：
[0020]
[0021] 本发明未详尽说明的，均按本领域常规技术。
[0022] 本发明的有益效果如下：
[0023] 1、本发明的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料中，透明质酸寡糖的分子量是明 确且单一的，而非混合物，可由酶解、凝胶层析辅助ESI-MS的方法制备，可望具备与普通大 分子透明质酸显著不同的诱导血管生成、促进创伤愈合等的功能。胶原蛋白与透明质酸都 是来自肌体组织本身的纯天然材料，具有优良的生物相容性，使得本发明的透明质酸寡糖 修饰的胶原蛋白新材料在良好的生物相容性的基础上，有望具备诱导血管生成、促进组织 更好修复的性能。
[0024] 2、本发明的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料的制备过程简单，成本低廉，制 备的新材料在组织修复材料和药物载体领域有潜在的广阔前景。
[0025] 3、本发明通过酶解法酶解并分离纯化大量制备得到透明质酸寡糖，通过交联制备 透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白，实现了透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白的批量化生产。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明中制备的透明质酸十糖（a)、八糖（b)、六糖（c)和四糖（d)的质谱 图谱。
[0027] 图2为本发明实施例1中透明质酸十糖含量为2. 6wt%的透明质酸寡糖修饰的胶 原蛋白新材料的红外光图谱。
【具体实施方式】