具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药材料领域，特别涉及具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物及 其制备方法，以及所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物作为药物载体的应用。
【背景技术】
[0002] 癌症已经成为人类健康的最大威胁之一，化疗是目前治疗癌症的重要手段，但传 统的抗癌药物制剂在体内的选择性差，大多数抗癌药物在杀死癌细胞的同时也会对正常组 织产生一定的毒性从而引起正常细胞的死亡。近年来，以药物安全、高效治疗为目的的抗肿 瘤靶向给药系统，特别是聚合物胶束的抗肿瘤靶向给药系统的研究和开发成为了药物制剂 工作者的研究热点之一。
[0003] 聚合物胶束是由两亲性共聚物在水性介质中自组装形成，具有内部疏水、外部 亲水的核-壳结构。聚合物胶束作为纳米级药物载体材料，具有粒径小、体内外稳定性 高、提高难溶性药物的溶解度、通过增强渗透和滞留效应（EPR效应）达到被动靶向的优 势。研究表明，纳米载药体系进入体内后可通过EPR效应相对选择性地聚集在肿瘤部位， 粒径约为400nm的脂质体囊泡容易从血管渗入肿瘤组织（MacEwan SR, Callahan DJ，et al. Nanomedicine (Lond) 2010.)，也有研究表明，直径小于200nm的纳米载药体系具有更好 的治疗效果（Hobbs SK, Monsky WL，et al.Proc Natl Acad Sci, 1998.) 〇
[0004] Y. Sun等合成了主链中含二硫键的还原敏感型聚胺-胺聚合物，该聚合物装载阿 霉素后形成纳米载药胶束，载药胶束可通过EPR效应在肿瘤组织中聚集，载药胶束进入肿 瘤细胞后，所述聚合物因其二硫键被癌细胞内的高度还原势能还原而降解，释放出阿霉素 发挥抗癌作用（Y. Sun, W. Zou, S. Bian, et al. Biomaterials, 2013, 34, 6818 - 6828.)。众所 周知，载药胶束在肿瘤组织中聚集只是其发挥靶向抗癌作用的基础，更关键的是载药胶束 能否顺利、快速地进入癌细胞内部并释放出药物。虽然上述载药胶束可通过EPR效应聚集 在肿瘤组织中，但是，给药物小分子加上载体保护层，必然就给药物小分子扩散进入癌细胞 增加了一层障碍，导致载药胶束进入癌细胞的速度较慢。然而，体内环境十分复杂，聚集在 肿瘤组织中的载药胶束对于机体本身而言都是异物，若聚集在肿瘤组织的载药胶束未及时 地进入癌细胞内部，它们又会随着血液的全身循环被机体自身的免疫系统清除掉，导致药 物的生物利用度较低。因此，开发出能够有效在肿瘤组织聚集并快速进入癌细胞内部的药 物载体，对于提高抗癌药物的生物利用度，进而提高抗癌药物的疗效具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有精氨酸穿膜作用的还原敏 感型聚合物及其制备方法，本发明还提供了一种上述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚 合物作为药物载体的应用，以加快药物载体进入癌细胞的速度，提高药物的生物利用度和 治疗效果。
[0006] 本发明提供的具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物，结构式如下：
[0007]
[0008] 上述结构式中，x、y、z、m、n为重复单元的个数，x彡1，y彡1，z彡1，m = 20~ 45, n = 20 ~45。
[0009] 上述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物中，x，y，z的值可根据实际应用需 求进行调整，例如，当所述聚合物作为疏水性药物载体时，z值应占主要比重，当所述聚合物 作为带负电荷的基因或者带负电荷的蛋白质载体时，x、y的值应占主要比重；x，y，z的值优 选为x = l~5，y = l~5，z = 4~8〇
[0010] 上述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物在水中自组装形成纳米胶束，所述 纳米胶束的粒径不超过l〇〇nm。
[0011] 本发明提供的具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备方法，步骤如下：
[0012] (1)胱胺双丙烯酰胺单体的制备
[0013] 将丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液与胱胺二盐酸盐水溶液混合形成反应体系，在搅 拌下于〇~5°C向反应体系中滴加除酸剂水溶液，滴加完毕后，在10~30°C搅拌反应16~ 24h，固液分离，将所得固相洗涤、重结晶并真空干燥，即得胱胺双丙烯酰胺单体；
[0014] 所述丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液中，丙烯酰氯与二氯甲烷的体积比为 1: (0. 1~10)，所述胱胺二盐酸盐水溶液中胱胺二盐酸盐的浓度为1~100mol/L，所述反应 体系中，胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯、除酸剂的摩尔比为1: (2~10) : (4~10);
[0015] (2)Boc保护的聚胺-胺的制备
[0016] 将步骤⑴所得胱胺双丙烯酰胺单体、苯乙胺和一端Boc保护的乙二胺混合，在真 空条件下于100~200°C反应36~48h即得固态产物，将该固态产物溶于第一溶剂形成溶 液后滴加至乙醚中，收集沉淀物并真空干燥，即得Boc保护的聚胺-胺；
[0017]所述胱胺双丙烯酰胺单体与一端Boc保护的乙二胺的摩尔比为（5~9) : (1~5)， 一端Boc保护的乙二胺与苯乙胺的摩尔比为（6~9) : (1~4)，所述第一溶剂的用量应使固 态产物在所述溶液中的浓度为1~l〇〇g/L，第一溶剂与乙醚的体积比为1: (10~30);
[0018] (3)聚胺-胺的制备
[0019]将步骤（2)所得Boc保护的聚胺-胺、二氯甲烷和脱保护剂混合形成混合液，在搅 拌下于〇~5°C反应1~6h，将所得反应液滴加到乙醚中，收集沉淀物并将其真空干燥，即 得聚胺-胺；所述二氯甲烷与脱保护剂的体积比为1: (1~10)，Boc保护的聚胺-胺的用量 应使所述混合液中Boc保护的聚胺-胺的浓度为0. 01~10mg/mL，反应液与乙醚的体积比 为 1: (10 ~30);
[0020] 或者将步骤（2)所得Boc保护的聚胺-胺与二氯甲烷混合后，在通入氯化氢气体 的条件下于〇~5°C反应1~6h，将所得反应液减压蒸馏除去二氯甲烷，收集沉淀产物并真 空干燥，即得聚胺-胺；
[0021] (4)两亲聚乙二醇接枝的聚胺-胺接枝共聚物的制备
[0022] 将步骤⑶所得聚胺-胺、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺-聚 乙二醇-马来酰亚胺加入第二溶剂中形成混合液，在搅拌下于10~30°c反应2~10h，将 所得反应液用pH值为7~9的磷酸盐缓冲溶液透析，将透析产物冷冻干燥或真空干燥，即 得两亲聚乙二醇接枝聚胺-胺的接枝共聚物；
[0023] 所述聚胺-胺、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马 来酰亚胺的摩尔比为10: (8~4) : 1，第二溶剂的用量应使混合液中聚胺-胺的浓度为1~ 100mmol/L ；
[0024] (5)具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备
[0025] 将步骤（4)所得两亲聚乙二醇接枝聚胺-胺的接枝共聚物与半胱氨酸修饰的八 聚精氨酸加入pH值为7~9的磷酸盐缓冲溶液中形成混合液，在搅拌下于10~30°C反应 1~6h，将所得反应液用去离子水透析，将透析产物冷冻干燥或真空干燥，即得具有精氨酸 穿膜作用的还原敏感型聚合物；
[0026] 所述两亲聚乙二醇接枝聚胺_胺的接枝共聚物与半胱氨酸修饰的八聚精氨酸的 摩尔比为（1~10) :1，磷酸盐缓冲溶液的用量应使混合液中半胱氨酸修饰的八聚精氨酸的 浓度为1~100mmol/L。
[0027] 上述方法的步骤（4)和（5)中，采用截留分子量为8000~14000道尔顿的透析袋 进行透析。
[0028] 上述方法中，所述除酸剂为无机碱，除酸剂水溶液中除酸剂的浓度为1~25mol/ L〇
[0029] 上述方法中，所述脱保护剂为三氟乙酸或者盐酸的乙酸乙酯饱和溶液。
[0030] 上述方法中，所述第一溶剂为甲醇或者N，N_二甲基甲酰胺，第二溶剂为二甲基亚 砜或者N，N_二甲基甲酰胺。
[0031] 上述方法中，当步骤（2)采用通入氯化氢气体的技术方案时，氯化氢气体的流量 为 10 ~20mL/min。
[0032] 上述方法的步骤（2)中，在真空条件下反应的目的是为了减少氧气的阻聚作 用，以提高聚合产物的分子量，真空度越高，减少氧气的阻聚作用越明显，该步骤优选 在-0. 3~-0.1 MPa的条件下进行。
[0033] 本发明还提供了一种上述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物作为药物载 体的应用，所述药物为疏水性抗肿瘤药物、带负电荷的蛋白质、带负电荷的基因中的至少一 种。
[0034] 实际应用时，可采用以下方法制备载药胶束：
[0035] 将本发明所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物溶解于溶剂中形成聚合 物溶液，将药物溶解于溶剂中形成药物溶液，然后将所述聚合物溶液和药物溶液混合均 匀形成混合液，将所述混合液在超声条件下滴加到去离子水中，然后装入截留分子量为 8000~14000道尔顿的透析袋中置于去离子水中透析除去小分子杂质，将透析产物浓缩、 干燥即得载药胶束。
[0036] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0037] 1.本发明提供了一种具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物，该聚合物在水性 介质中能自组装形成核 -壳结构的胶束，由于该聚合物中含有聚精氨酸结构，该结构能加 快聚合物穿透细胞膜进入癌细胞内部的速度，同时该聚合物中的二硫键可被癌细胞内较高 的还原势能降解，上述特点都是靶向药物载体的重要特质，因此本发明提供的聚合物非常 适合作为药物载体使用。
[0038] 2.试验表明，本发明所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物装载疏水性药 物后形成