牡丹内生真菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物内生真菌技术领域，具体涉及一种产丹皮酚的牡丹内生真菌及其 应用。
【背景技术】
[0002] 植物内生真菌是指整个生活史或者生活史中的某一个阶段存在于植物组织内部 或者组织间隙，且不会引起宿主出现明显病症或者没有对宿主造成明显伤害的一类真菌。 国内外越来越多的研究表明，植物在与内生真菌相互作用的过程中，内生真菌能产生与植 物相同或相似的活性物质。内生真菌次生代谢产物的种类繁多，包括生物碱类、醌类、酸、甾 体类、萜类、肽类等，药理活性广泛，主要表现为抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫、抗结核等。目 前，从药用植物中分离培养能产生活性物质的内生真菌已成为学者的研究趋势。
[0003] 牡丹是我国特有的木本名贵花卉，在我国山东菏泽、安徽铜陵、重庆垫江、河南洛 阳等地均有大规模商品化种植。丹皮又称为牡丹皮，为牡丹的干燥根皮，其性微寒，味苦、 辛，归心、肝、肾经，具有清热凉血、活血化瘀的功效，为我国传统中药材。丹皮酚是牡丹丹皮 中主要的有效药用活性成分，凤丹皮作为丹皮中的道地药材，其丹皮酚含量最高。丹皮酚具 有解热、镇痛、抗真菌、抗病毒、抗癌等作用。从牡丹中分离出能产生丹皮酚的内生真菌，将 为丹皮酚的生产提供有益帮助。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种产丹皮酚的牡丹内生真菌。
[0005] 同时，本发明还提供一种上述牡丹内生真菌在生产丹皮酚或制备生防菌剂中的应 用。
[0006] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0007] 牡丹内生真菌，为镰刀菌属（Fusariumsp.)A7J2_01，保藏编号：CCTCCN0:M 2014663,保藏日期：2014年12月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏 地址：中国.武汉.武汉大学（湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心）。
[0008] 牡丹内生真菌（CCTCCN0:M2014663)为镰刀菌属，镰刀菌属无性时期原属于半知 菌类，丛梗孢目，瘤座孢科。在PDA培养基上生长5d后，菌落呈现白色，呈平铺状生长，菌落 直径达到7cm，几乎覆盖整个平板，菌丝生长高度达到0. 3cm，培养基背面呈现较深的灰色， 菌落质地较为疏松，继续培养到30d，菌落颜色慢慢转为棕褐色，培养基背面呈现的灰色继 续加深，最终变为黑色。观察显微结构，发现分生孢子梗短粗，分生孢子无色，大型分生孢子 两端尖，弯曲状，呈镰刀形。其生长温度为25°C，生长pH值自然。
[0009] 牡丹内生真菌（CCTCCNO:M2014663)在生产丹皮酚中的应用。
[0010] 牡丹内生真菌（CCTCCN0:M2014663)在制备生防菌剂中的应用。
[0011] 本发明的有益效果：
[0012] 本发明从牡丹植株中分离出一株能够产丹皮酚的内生真菌A7J2-01，其在PDA培 养基上生长5d后，菌落呈现白色，呈平铺状生长，菌落直径达到7cm，几乎覆盖整个平板，菌 丝生长高度达到〇. 3cm，培养基背面呈现较深的灰色，菌落质地较为疏松，继续培养到30d， 菌落颜色慢慢转为棕褐色，培养基背面呈现的灰色继续加深，最终变为黑色。观察显微结 构，发现分生孢子梗短粗，分生孢子无色，大型分生孢子两端尖，弯曲状，呈镰刀形。ITS序列 分析表明，内生真菌A7J2-01基因组扩增序列与序列号KF624786. 1的序列相似性高达99% 以上，结合形态学观察结果，鉴定该内生真菌为镰刀菌属（Fusariumsp.)，保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2014663。
[0013] 本发明中牡丹内生真菌（CCTCCN0:M2014663)能够合成丹皮中主要的有效成分 丹皮酚，通过大规模发酵培养镰刀菌属A7J2-01，即可在短时间内获得大量菌丝，从而获得 丹皮酚，该方法可替代采挖植物药材获得丹皮酚，为生产丹皮酚提供新的思路。
[0014] 保藏证明和存活证明说明
[0015] 保藏菌株：牡丹内生真菌，为镰刀菌属（Fusariumsp. )A7J2-01，保藏编号： CCTCCN0:M2014663,保藏日期：2014年12月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学（湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中 心）。
【附图说明】
[0016] 图1为实施例1中供试品A7J2-01提取液的GC色谱图；
[0017] 图2为对照品丹皮酚的GC色谱图；
[0018] 图3为内生真菌A7J2-01的菌落形态图；
[0019] 图4为内生真菌A7J2-01的孢子囊形态图；
[0020] 图5为内生真菌A7J2-01基因组PCR扩增产物的电泳图；
[0021] 图6为内生真菌A7J2-01的系统进化树；
[0022] 图7为丹皮酚对照品的标准曲线。
【具体实施方式】
[0023] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0024] 实施例1
[0025] -、牡丹内生真菌的分离培养
[0026] 牡丹内生真菌（CCTCCN0:M2014663)分离自健康的人工种植的安徽凤丹的根、 茎、叶，凤丹采自中国安徽铜陵凤凰山，植株年龄五年，植株健壮，无病虫害（详见"遗传资 源来源披露登记表"）。
[0027] 具体的分离培养步骤如下：
[0028] 1)将五年生牡丹植株的根和茎切成1. 5cm左右的小段，叶切成2cm2左右的小片， 在超净工作台内对其表面消毒：根和茎分别用75%的酒精浸泡lmin，无菌水冲洗干净，再 浸泡于5 %次氯酸钠溶液4min，无菌水冲洗干净，在无菌水中漂洗；叶用75 %的酒精浸泡 20s，无菌水冲洗干净，在无菌水中漂洗，再浸泡于5%次氯酸钠溶液45s，无菌水冲洗干净， 在无菌水中漂洗；
[0029] 2)将消毒过的根和茎用无菌手术刀纵向剖开，叶剪成梳状，将根和茎的纵剖面平 铺在加有庆大霉素（4万U/L)的PDA培养基平皿上，叶平铺在平皿中，各重复5次，同时取 消毒过程中的前中后三个阶段的漂洗液滴在培养皿中做对照来验证表面消毒的状况；
[0030] 3)将上述培养皿放入25°C恒温培养箱中培养，每天定时观察记录内生真菌的生 长状况，在培养基上观察到有菌丝生成时，及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝 或菌落移种到新鲜PDA培养基上，继续培养，待长出菌丝后继续分离纯化，直到分离到单一 菌株；
[0031] 4)将单一菌株接种在PDA试管斜面培养基中，4°C保存备用。
[0032] PDA培养基制备方法如下：取新鲜马铃薯200g，切块，用蒸馏水煮沸30min，四层纱 布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20g，琼脂17g充分溶解后再用蒸馏水补足到1000mL。将配 成的培养基在121°C下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌培养皿中备用。
[0033] 斜面PDA培养基为：取5mLPDA培养基装于试管中，121°C高压灭菌30min，铺成斜 面冷却，以备保存菌种。
[0034] 结果：从五年生安徽凤丹的根、茎、叶中分离出内生真菌21株，并且对照组培养基 上并未长菌，证明所消毒程序彻底，分离到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。
[0035] 二、牡丹内生真菌产丹皮酚能力的测定
[0036] 将分离到的单一菌株进行扩大培养：分离到的每株内生真菌接种20个90mm的 PDA培养皿，倒置在25°C恒温培养箱中培养25天，待菌丝成熟后，用无菌手术刀片刮取菌 丝，将刮取的菌丝用无水甲醇进行研磨，研磨碎之后按照lg/20mL料液比用甲醇定容，在室 温下进行超声浸提30分钟，取浸提液加入2mL离心管中，以8000r/min的转速离心10分钟， 之后取上清液，用〇. 22ym的微孔滤膜进行过滤，取其滤液做成内生真菌提取物。同时，将 市售的丹皮酚标准品晶体用甲醇溶解，做成标准品溶液。
[0037] 取内生真菌提取物进行GC检测，丹皮酚的标准品同时也进行GC检测，GC检测条 件：色谱柱为AgilentHP-5MS石英毛细管柱（30mX0.25mmX0.25ym);载气为高纯氦气， 流速为lmL.minS