一种溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制 剂的工业化多级联通液体发酵方法。
【背景技术】
[0002] 随着水产养殖业迅猛发展，养殖过程产生的大量残饵、代谢产物造成池塘水体富 营养化日益加剧，导致蓝藻大量繁殖，蓝藻水华高频率爆发（彭聪聪等，2011)。蓝藻会大量 耗氧且能释放蓝藻毒素、羟胺及硫化氢等有毒有害物质，严重败坏养殖水体，造成养殖对象 的中毒死亡，对水体生态环境和养殖效益造成巨大影响（刘孝竹等，2009)。有研究表明， 利用溶藻菌可特异性地抑制有害微藻，达到优化水体微藻群落的效果（赵以军，1996 ;裴海 燕等，2005 ;王祥荣等，2010)。当前该领域的研究热点还主要为针对海洋赤潮和湖沼水华 的有害微藻种类的特性与治理等方面，YANG等筛选了溶解赤潮中肋骨条藻（Skeletonema ostatum)的溶藻菌SK_5(YANGetal，2013)，THEERASAK等筛选了杀灭引起蓝藻水华的铜 绿微囊藻（Microcystisaeruginosa)的放线菌（THEERASAKetal, 2013)，但有关运用溶 藻菌抑制池塘水体有害微藻的研究少见报道（TEEYAPORNetal，2012;贾雯等，2013)。池 塘环境与上述水体环境差异巨大，在微藻优势种群结构、水体营养水平、人工技术措施等方 面的差别致使针对开放性水域的相关研究无法直接借鉴到养殖生产应用中。对此，曹煜成 等筛得了一株池塘蓝藻溶藻菌一蜡样芽孢杆菌（BacilluscereuS)CZBCl，该菌株对养殖池 塘中的颤藻、微囊藻等有害蓝藻具有良好的溶藻专一性（曹煜成等，ZL201310 203745. 3)。 另有报道，蜡样芽孢杆菌广泛存在于环境中，它属于革兰氏阳性菌，其非毒性菌株可用以调 节生物消化道菌群，净化养殖水质，促进养殖生物健康生长，目前已被应用于医药、农业生 产等领域（李煜等，2012 ;李侠等，2001)。阳钢等通过向水体泼洒蜡样芽孢杆菌BC-1有效 提高了刺参的生长速度（阳钢等，2012)，何鉴尧等筛得两株蜡样芽孢杆菌L7和L8对螺旋 鞘丝藻均有显著地控制效果（何鉴尧等，2008)。
[0003]近年来，报道的溶藻细菌主要有：黄杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、 噬胞菌属、交替假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、腐生螺旋体属、屈挠细菌属、纤维弧菌属及蛭 弧菌属等。曹煜成等筛得的蜡样芽孢杆菌CZBC1经实验室生态学试验证实，其具有适应广 温、广盐、耐高pH和低耗氧的特性，可以通过直接或间接机制溶解浮游颤藻、绿色颤藻、小 颤藻等有害蓝藻，具有良好的颤藻溶解专一性，对其他优良绿藻和硅藻等无溶解效应，并且 对养殖对虾也无不良影响，适宜池塘水产养殖生产应用（曹煜成，2014)。
[0004]目前针对蜡样芽孢杆菌CZBC1菌剂的工业化液体发酵生产方法还未见报道。虽然 有学者就蜡样芽孢杆菌发酵工艺、溶藻菌发酵条件优化等进行过报道（王海云等，一株蜡 样芽胞杆菌及其制备方法应用，申请号201410223612. 7 ;朱杰等，芽孢杆菌属溶藻菌的固 体发酵与应用，申请号201210308126. 6 ;孙梅等，一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌 剂的方法和应用，申请号201310413693. 2;荣小军等，一种蜡样芽孢杆菌及其制剂和应用， 申请号201010602326. 3 ;叶姜瑜等，响应曲面法优化溶藻细菌发酵条件的研究，2011 ;许珂 等，溶藻细菌W5培养条件优化及发酵培养）。由于蜡样芽孢杆菌不是所有菌株都具备溶藻 特性，而上述研究中的溶藻菌亦并非本专利所涉及的蜡样芽孢杆菌或类似的溶藻菌株，加 之有关溶藻菌发酵研究的报道仍多为研究性质，远未达到菌剂的工业化发酵生产的需求， 也未见相关菌剂的工业化生产产品。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通 液体发酵方法，该方法确定了发酵工艺参数，一方面保证该方法可满足蜡样芽孢杆菌制剂 产品的工业化液体发酵生产需求，另一方面保证形成的蜡样芽孢杆菌制剂产品并未因工业 化和规模化的生产致使其溶藻特性丢失或发生改变，仍具有良好的颤藻溶解专一性，对优 良绿藻和硅藻无溶解效应，对养殖对虾也无不良影响，可用于养殖生产应用。
[0006] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种溶解池塘颤藻的蜡样芽孢 杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法，包括以下步骤：
[0007] (1)确定蜡样芽孢杆菌CZBC1的多级联通发酵罐培养的发酵培养基；
[0008] (2)活化培养：将保种的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行活化培养，得活化的蜡样芽 孢杆菌CZBC1;
[0009] (3)摇瓶种子液培养：将步骤（2)中活化好的蜡样芽孢杆菌CZBC1置于种子瓶中， 恒温振荡培养，得摇瓶种子液；
[0010] (4)多级联通发酵罐培养：多级联通发酵罐的大小依次为50U500L和5000L，每 个发酵罐中装有步骤（1)中确定的发酵培养基，首先将摇瓶种子液接种到50L发酵罐中进 行发酵培养至菌种浓度达到109cfu/mL以上，接着取50L发酵罐中的种子液接种到500L发 酵罐中继续培养至菌种浓度达到109cfu/mL以上，最后取500L发酵罐中的种子液接种到 50001发酵罐中继续培养至芽孢数量达到101°个/ 1^以上，且芽孢的获得率达到95%以上 时，将发酵液引入离心机；
[0011] (5)菌泥制备及载体复合：将发酵液引入离心机离心后，取菌泥，将菌泥与载体混 匀后经包括干燥、粉碎、包装和抽检工序处理后，得蜡样芽孢杆菌制剂产品。
[0012] 在上述溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法中：
[0013] 步骤（1)中蜡样芽孢杆菌CZBC1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCCNO：M2013130〇
[0014] 步骤（1)中确定蜡样芽孢杆菌CZBC1的发酵培养基：主要根据蜡样芽孢杆菌 CZBC1的芽孢形成率和菌剂发酵产品的溶藻效率，确定蜡样芽孢杆菌CZBC1的发酵培养基。
[0015] 步骤（1)中确定的蜡样芽孢杆菌CZBC1的发酵培养基为在1L水中含有葡萄糖 0? 6g~8.5g、糖蜜0? 6g~8.5g、酵母膏5~7g、蛋白胨5~7g、大豆蛋白18~23g、NaCl 0? 8~1. 3g、KH2P040. 15~0? 3g和MgS040. 15~0? 3g。
[0016] 进一步的，蜡样芽孢杆菌CZBC1的发酵培养基为在1L水中含有葡萄糖7. 5g、糖蜜 7. 5g、酵母膏5g、蛋白胨5g、大豆蛋白20g、NaCllg、KH2P040 . 2g和MgS040 . 2g时，蜡样芽孢 杆菌CZBC1的芽孢形成率和菌剂发酵产品的溶藻效率最佳。
[0017] 步骤（2)中蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行活化培养时采用的营养基为营养肉汤固 体培养基，营养肉汤固体培养基的pH6. 50~7. 20, 28~30°C温度活化培养18~24h。
[0018] 步骤（3)中恒温振荡培养时米用的培养液为营养肉汤液体培养基，营养肉汤液体 培养基的PH6. 50~7. 20,180~230rpm，28~30°C恒温振荡培养18~24h。
[0019] 步骤（4)中发酵培养基的体积占每个发酵罐总容积的65~70%。
[0020] 步骤（4)中将摇瓶种子液接种到50L发酵罐中进行发酵培养时摇瓶种子液的接种 量优选占发酵培养基总体积的3~5%，发酵培养时间为18~24h;取50L发酵罐中的种子 液接种到500L发酵罐中继续培养时种子液的接种量占500L发酵罐中发酵培养基总体积的 3~5%，发酵培养时间为18~24h;取500L发酵罐中的种子液接种到5000L发酵罐中继 续培养时种子液的接种量占5000L发酵罐中发酵培养基总体积的3~5%。
[0021] 本发明步骤（4)中将将菌液引入离心机时，优选采用无缝联通导管引入，联通导 流管的菌液流速优选为380~430L/h，从而实现发酵系统与菌液后处理系统中的离心机实 行无缝联通传输，确保菌剂产品制备过程中不受其他微生物的污染。
[0022] 步骤（4)中的发酵系统和联通导管等管路在使用前最好进行灭菌处理，灭菌处理 可以在120~125°C高温灭菌20~25min，再将各发酵罐和联通导管等管路冷却至接种温 度即可。接种温度室温即可，25~30°C均可。
[0023] 步骤（4)中多级发酵罐联通培养时，每次将种子液接种至发酵罐中进行发酵培养 后，最好都取样进行实验室显微镜检查，确认菌种未受杂菌污染，然后再接种入下一发酵罐 进行接种培养。
[0024] 因此，进一步的，步骤（4)中以65~70%的装液量配置好各发酵罐所需的培养基， 开启锅炉对发酵罐及管路进行灭菌操作（12rC，20min)，再冷却至接种温度（室温，如25~ 30°C)，将实验室显微镜检查合格的摇瓶种子液，以3~5%的量接种到50L的发酵罐培养 18~24h，取样进行实验室显微镜检查，确认发酵菌液中的菌种未受杂菌污染，且数量达到 109cfu/mL以上后移种到500L的发酵罐培养18~24h，取样进行实验室显微镜检查，确认 菌种未受杂菌污染，数量达到109cfu/mL以上即移种至5000L的发酵罐发酵培养18~24h， 然后取样检查，保证发酵菌液中的菌种未受杂菌污染，芽孢数量1〇1(：个/mL以