产3-羟基丙酸均聚物/共聚物的重组菌及构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种用于生产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基 丙酸共聚物的重组菌及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 利用代谢工程技术改造微生物已成为一种行之有效的方法来生产化学产品以及 新型的生物材料。聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates或PHA)是一类在微生物细胞 内合成并积累而且具有生物可降解性和生物相容性的聚合物（SteinbUchel, A.，Fuchtenb usch,B.,1998. Bacterial and other biological systems for polyester production. Trends Biotechnol. 16,419-427.)。随着对其深入的研究，聚羟基脂肪酸酯在环保材料、 生物医学和生物能源方面将极具应用价值（Chen GQ. A Polyhydroxyalkanoates Based Bi〇-and Materials Industry. Chem Soc Rev 38 (2009)2434 - 2446)〇
[0003] 根据单体的结构组成，PHA可分为短链和中长链两类：前者的单体组成为碳链长 为C3到C5,后者的单体组成为C6到C14。
[0004] 3-羟基丙酸均聚物是目前开发的机械强度最高的生物可降解高分子聚合物，属于 短链聚合物的一种，其优越的理化性能将使其成为一种可广泛应用的生物材料。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于生产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物 的重组菌及其构建方法与应用。
[0006] 本发明所提供的方法可为利用葡萄糖合成由3-羟基丙酸和3-羟基丁酸组成的共 聚物的重组菌A的制备方法，具体可包括如下步骤：将甘油三磷酸脱氢酶的编码基因（gpd 基因）、三磷酸甘油磷酸酶的编码基因（gpp基因）、甘油脱水酶1的编码基因（dhaBl基因）、 甘油脱水酶2的编码基因（dhaB2基因）、甘油脱水酶3的编码基因（dhaB3基因）、甘油脱水 酶激活酶A的编码基因（GdrA基因）、甘油脱水酶激活酶B的编码基因（GdrB基因）、3_羟 基丙醛脱氢酶的编码基因（pduP基因）、PHA聚合酶的编码基因（phaC基因）、3_羟基丙酰 辅酶A连接酶的编码基因（pcs'基因）、0 -酮基硫解酶的编码基因（phaA基因）和NADPH 依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶的编码基因（phaB基因）导入受体菌，得到重组菌A。
[0007]在本发明中，将所述甘油三磷酸脱氢酶的编码基因（gpd基因）、所述三磷酸甘油 磷酸酶的编码基因（gpp基因）、所述甘油脱水酶1的编码基因（dhaBl基因）、所述甘油脱 水酶2的编码基因（dhaB2基因）、所述甘油脱水酶3的编码基因（dhaB3基因）、所述甘油 脱水酶激活酶A的编码基因（GdrA基因）、所述甘油脱水酶激活酶B的编码基因（GdrB基 因）、所述3-羟基丙醛脱氢酶的编码基因（pduP基因）、所述PHA聚合酶的编码基因（phaC 基因）、所述3-羟基丙酰辅酶A连接酶的编码基因（pcs'基因）、所述0 -酮基硫解酶的编 码基因（phaA基因）和所述NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶的编码基因（phaB基因） 导入受体菌，除所述PHA聚合酶的编码基因（phaC基因）为两次导入外，其余所有的编码基 因均为单次导入。
[0008] 本发明所提供的方法也可为利用葡萄糖合成3-羟基丙酸均聚物的重组菌B的制 备方法，具体可包括如下步骤：将甘油三磷酸脱氢酶的编码基因（gpd基因）、三磷酸甘油磷 酸酶的编码基因（gpp基因）、甘油脱水酶1的编码基因（dhaBl基因）、甘油脱水酶2的编 码基因（dhaB2基因）、甘油脱水酶3的编码基因（dhaB3基因）、甘油脱水酶激活酶A的编 码基因（GdrA基因）、甘油脱水酶激活酶B的编码基因（GdrB基因）、3_羟基丙醛脱氢酶的 编码基因（pduP基因）、PHA聚合酶的编码基因（phaC基因）和3-羟基丙酰辅酶A连接酶 的编码基因（pcs'基因）导入受体菌，得到重组菌B。
[0009] 在本发明中，将所述甘油三磷酸脱氢酶的编码基因（gpd基因）、所述三磷酸甘油 磷酸酶的编码基因（gpp基因）、所述甘油脱水酶1的编码基因（dhaBl基因）、所述甘油脱 水酶2的编码基因（dhaB2基因）、所述甘油脱水酶3的编码基因（dhaB3基因）、所述甘油 脱水酶激活酶A的编码基因（GdrA基因）、所述甘油脱水酶激活酶B的编码基因（GdrB基 因）、所述3-羟基丙醛脱氢酶的编码基因（pduP基因）、所述PHA聚合酶的编码基因（phaC 基因）和所述3-羟基丙酰辅酶A连接酶的编码基因（pcs'基因）导入所述受体菌中，对于 每个编码基因来说均为单次导入。
[0010] 本发明所提供的方法还可为利用葡萄糖合成3-羟基丙酸均聚物的重组菌C的制 备方法，具体可包括：
[0011] 将甘油三磷酸脱氢酶的编码基因（gpd基因）、三磷酸甘油磷酸酶的编码基因（gpp 基因）、甘油脱水酶1的编码基因（dhaBl基因）、甘油脱水酶2的编码基因（dhaB2基因）、 甘油脱水酶3的编码基因（dhaB3基因）、甘油脱水酶激活酶A的编码基因（GdrA基因）、甘 油脱水酶激活酶B的编码基因（GdrB基因）、PHA聚合酶的编码基因（phaC基因）、3_羟基 丙酰辅酶A连接酶的编码基因（pcs'基因）、醇脱氢酶的编码基因（dhaT基因）和醛脱氢酶 的编码基因（aldD基因）导入受体菌，得到重组菌C。
[0012] 在本发明中，将所述甘油三磷酸脱氢酶的编码基因（gpd基因）、所述三磷酸甘油 磷酸酶的编码基因（gpp基因）、所述甘油脱水酶1的编码基因（dhaBl基因）、所述甘油脱 水酶2的编码基因（dhaB2基因）、所述甘油脱水酶3的编码基因（dhaB3基因）、所述甘油 脱水酶激活酶A的编码基因（GdrA基因）、所述甘油脱水酶激活酶B的编码基因（GdrB基 因）、所述PHA聚合酶的编码基因（phaC基因）、所述3-羟基丙酰辅酶A连接酶的编码基因 (pcs'基因）、所述醇脱氢酶的编码基因（dhaT基因）和所述醛脱氢酶的编码基因（aldD基 因），对于每个编码基因来说均为单次导入。
[0013] 前文涉及的各种酶的氨基酸序列如下：
[0014] 所述甘油三磷酸脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列13或保有功能的随机或/ 和定点诱变序列；所述三磷酸甘油磷酸酶的氨基酸序列为序列表中序列14或保有功能的 随机或/和定点诱变序列；所述甘油脱水酶1的氨基酸序列为序列表中序列15或保有功能 的随机或/和定点诱变序列；所述甘油脱水酶2的氨基酸序列为序列表中序列16或保有功 能的随机或/和定点诱变序列；所述甘油脱水酶3的氨基酸序列为序列表中序列17或保有 功能的随机或/和定点诱变序列；所述甘油脱水酶激活酶A的氨基酸序列为序列表中序列 18或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述甘油脱水酶激活酶B的氨基酸序列为序列 表中序列19或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述3-羟基丙醛脱氢酶的氨基酸序 列为序列表中序列20或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述PHA聚合酶的氨基酸序 列为序列表中序列21或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述3-羟基丙酰辅酶A连 接酶的氨基酸序列为序列表中序列22或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述醇脱氢 酶的氨基酸序列为序列表中序列23或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述醛脱氢酶 的氨基酸序列为序列表中序列24或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述酮基硫 解酶的氨基酸序列为序列表中序列25或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述NADPH 依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶的氨基酸序列为序列表中序列26或保有功能的随机或/和 定点诱变序列。
[0015] 进一步，前文涉及的各种酶的编码基因的核苷酸序列如下：
[0016] 所述甘油三磷酸脱氢酶的编码基因（gpd基因）的核苷酸序列为序列表中序列1 或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述三磷酸甘油磷酸酶的编码基因（gpp基因）的 核苷酸序列为序列表中序列2或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述甘油脱水酶1 的编码基因（dhaBl基因）的核苷酸序列为序列表中序列3的第35-1702位或保有功能的 随机或/和定点诱变序列；所述甘油脱水酶2的编码基因（dhaB2基因）的核苷酸序列为序 列表中序列3的第1715-2299位或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述甘油脱水酶 3的编码基因（dhaB3基因）的核苷酸序列为序列表中序列3的第2302-2727位或保有功能 的随机或/和定点诱变序列；所述甘油脱水酶激活酶A的编码基因（GdrA基因）的核苷酸 序列为序列表中序列4或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述甘油脱水酶激活酶B 的编码基因（GdrB基因）的核苷酸序列为序列表中序列5或保有功能的随机或/和定点诱 变序列；所述3-羟基丙醛脱氢酶的编码基因（pduP基因）的核苷酸序列为序列表中序列6 或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述PHA聚合酶的编码基因（phaC基因）的核苷 酸序列为序列表中序列7或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述3-羟基丙酰辅酶A 连接酶的编码基因（pcs'基因）的核苷酸序列为序列表中序列8或保有功能的随机或/和 定点诱变序列；所述醇脱氢酶的编码基因（dhaT基因）的核苷酸序列为序列表中序列9或 保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述醛脱氢酶的编码基因（aldD基因）的核苷酸序 列为序列表中序列10或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述e-酮基硫解酶的编码 基因（phaA基因）的核苷酸序列为序列表中序列11或保有功能的随机或/和定点诱变序 列；所述NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶的编码基因（phaB基因）的核苷酸序列为序 列表中序列12或保有功能的随机或/和定点诱变序列。
[0017] 在以上提供的三种所述方法中，所述受体菌为革兰氏阴性菌。所述革兰氏阴 性菌可为大肠杆菌（Escherichia coli)、假单胞菌（Pseudomonas spp.)、嗜盐单胞菌 (Halomonas spp.)、罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha)或气生单胞菌（Aeromonas spp.) 等。这些菌自身含有能够编码具有三碳糖磷酸异构酶活性的蛋白的编码基因（tpi基因）。
[0018] 在本发明中，所述受体菌具体为大肠杆菌Transl-Tl。
[0019] 在所述重组菌B的制备方法中，所述甘油三磷酸脱氢酶的编码基因（gpd基因）、 所述三磷酸甘油磷酸酶的编码基因（gpp基因）、所述甘油脱水酶1的编码基因（dhaBl基 因）、所述甘油脱水酶2的编码基因（dhaB2基因）、所述甘油脱水酶3的编码基因（dhaB3 基因）、所述甘油脱水酶激活酶A的编码基因（GdrA基因）、所述甘油脱水酶激活酶B的编 码基因（GdrB基因）、所述3-羟基丙醛脱氢酶的编码基因（pduP基因）、所述PHA聚合酶的 编码基因（phaC基因）和所述3-羟基丙酰辅酶A连接酶的编码基因（pcs'基因）是以重 组表达载体A的形式导入所述受体菌中的。
[0020] 进一步，所述重组表达载体A为表达所述phaC基因、所述pcs'基因、所述dhaBl 基因、所述dhaB2基因、所述dhaB3基因、所述gpp基因、所述gpd基因、所述GdrA基因、所 述GdrB基因和所述pduP基因的载体。
[0021] 在所述重组菌C的制备方法中，所述甘油三磷酸脱氢酶的编码基因（gpd基因）、 所述三磷酸甘油磷酸酶的编码基因（gpp基因）、所述甘油脱水酶1的编码基因（dhaBl基 因）、所述甘油脱水酶2的编码基因（dhaB2基因）、所述甘油脱水酶3的编码基因（dhaB3 基因）、所述甘油脱水酶激活酶A的编码基因（GdrA基因）、所述甘油脱水酶激活酶B的编 码基因（GdrB基因）、所述PHA聚合酶的编码基因（phaC基因）和所述3-羟基丙酰辅酶A 连接酶的编码基因（pcs'基因）是以重组表达载体B的形式导入所述受体菌中的。所述醇 脱氢酶的编码基因（dhaT基因）和所述醛脱氢酶的编码基因（aldD基因）是通过重组表达 载体C的形式导入所述受体菌中的。
[0022] 进一步，所述重组表达载体B为表达所述phaC基因、所述pcs'基因、所述dhaBl 基因、所述dhaB2基因、所述dhaB3基因、所述gpp基因、所述gpd基因、所述GdrA基因、所 述GdrB基因的载体（pZQ03-dhaB-gpp-gpd-GdrAB载体）；所述重组表达载体C为pZQOl载 体。
[0023] 在所述重组菌A的制备方法中，所述甘油三磷酸脱氢酶的编码基因（gpd基因）、三 磷酸甘油磷酸酶的编码基因（gpp基因）、所述甘油脱水酶1的编码基因（dhaBl基因）、所 述甘油脱水酶2的编码基因（dhaB2基因）、所述甘油脱水酶3的编码基因（dhaB3基因）、 所述甘油脱水酶激活酶A的编码基因（GdrA基因）、所述甘油脱水酶激活酶B的编码基因 (GdrB基因）、所述3-羟基丙醛脱氢酶的编码基因（pduP基因）、所述PHA聚合酶的编码基 因（phaC基因）和所述3-羟基丙酰辅酶A连接酶的编码基因（pcs'基因）是以所述重组 表达载体A的形式导入所述受体菌中的。所述PHA聚合酶的编码基因（phaC基因）、所述 0 _酮基硫解酶的编码基因（phaA基因）和所述NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶的编 码基因（phaB基因）是以重组表达载体D的形式导入所述受体菌中的。
[0024] 进一步，所述重组表达载体D为表达所述phaA基因、所述phaB基因和所述phaC 基因的载体。
[0025] 由以上所述的方法制备得到的所述重组菌A、所述重组菌B或所述重组菌C也属于 本发明保护范围。
[0026] 所述重组菌A在利用葡萄糖合成由3-羟基丙酸和3-羟基丁酸组成的共聚物中的 应用，以及所述重组菌B或所述重组菌C在利用葡萄糖合成3-羟基丙酸均聚物中的应用也 属于本发明的保护范围。
[0027] 本发