一种用于检测梨黑斑病菌的引物及利用其检测梨黑斑病菌的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测梨黑斑病菌的引物，以及利用所述引物检测梨黑斑病菌 的分子检测方法。
【背景技术】
[0002] 梨黑斑病病菌（儿aiteraate)主要危害叶，果实和新梢，导致树体衰弱， 并引起贮藏期果实发病，造成重大经济损失。该病害在日本，法国，韩国等均有报道，在我 国多个省份均有发生，严重影响我国梨产业的发展。但采用传统的植物病害检测方法直接 观察，会遗漏发病初期未表现出症状的情况，且依赖形态学的检测方法易受到人为因素和 环境条件的干扰，加之传统的分类方法耗时长，程序繁琐，不适合快速检测的要求，很难实 现对病害发生的及时监测和有效控制病原菌的传播和病害流行。随着分子生物学技术的发 展，采用分子检测方法为该病害的诊断提供了很好的检测手段。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种梨黑斑病菌的检测方法及其引物，利用该 引物及检测方法检测梨黑斑病菌，速度快，准确，灵敏度高，稳定可靠。
[0004] 本发明提供的技术方案是： 一种用于检测梨黑斑病菌的引物，包括一对引物，其特征在于：其上游引物序列如 HB1所述，下游引物序列如HB2所述，其中， HB1 为：TCACCCTTGTCTTTTGCGTA HB2 为：ACCTTTGCTGATAGAGAGTG。
[0005] -种利用上述引物检测梨黑斑病菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作为 模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为 400bp的DNA条带，则证明所检测样品中含有梨黑斑病菌。
[0006] 上述的检测梨黑斑病菌的方法，所述PCR反应的扩增体系为：10XTaq buffer 2. 5ML、25mmol/L MgCl2 2.0ML、2.5mmol/L dNTP 2.0ML、10Mmol/L 正反向引物各 1. 〇ML、5U/L Tagase 0? 2ML、50 ng/MLDNA 模板 2ML,补水至总体积 25ML。
[0007] 所述的检测梨黑斑病菌的方法，所述PCR反应的反应程序为：94°C 4min; 94°C 30 s，55.8°C30 s, 72°C30 s, 35 个循环；72°C10min。4°C保存。
[0008] 本发明还提供另一种检测梨黑斑病菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作 为模板，利用两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，弓丨 物为真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4,第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物， 引物为所述的引物HB1和HB2，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳检测，如果存在分 子量约为400bp的DNA条带，则证明所检样品中含有梨黑斑病菌。
[0009] 本发明具有以下有益效果： 本发明通过设计一对特异性引物，结合PCR扩增的方法可以有效地检测植物组织中的 梨黑斑病菌。本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出 病原物，可参考应用于田间调查和植物产品的检验，对控制梨黑斑病的大面积爆发和跨区 域传播具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和 理论依据。
[0010] 本发明对从GeneBank中得梨黑斑病菌和其他属的rDNA-ITS序列进行分析，设计 了一对特异性引物，利用该引物对其他病原菌进行特异性扩增，发现只能从该属中扩增得 到一条400bp的条带，其他菌株均无扩增条带出现，表明该对引物具有属间特异性。以真菌 的rDNA-ITS序列设计特异性引物来进行病害的诊断和植物病原真菌的分子检测已得到广 泛应用。
[0011] 高灵敏度是病原菌检测的一个重要指标，它关系到能否快速检测技术直接应用在 植物产品的检验检疫中。在25PL的反应体系中，普通的PCR方法能检测到lng的基因组 DNA，在本发明建立的体系中采用套式PCR技术将检测基因组DNA的灵敏度提高到了 100 倍，只需要l〇pg的DNA即可检测到病菌的存在。
【附图说明】
[0012] 图1为根据GeneBank中所有梨黑斑病菌和其他属的rDNA-ITS序列进行分析设 计的一对特异性引物； 图2为特异性引物的验证，M :2000bp marker ;泳道1 :梨黑斑病菌；泳道2-23 :其他菌 株；泳道24:阴性对照； 图3为常规PCR对梨黑斑病菌的灵敏度检测，M :2000bp marker ;泳道1-9 :模板浓度 分别为 l〇〇ng，10ng，lng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg，lfg ;泳道 10 :阴性对照； 图4为套式PCR对梨黑斑病菌的灵敏度检测，M :2000bp marker ;泳道1-9 :模板浓度 分别为 l〇〇ng，10ng，lng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg，lfg ;泳道 10 :阴性对照； 图5为发病植株中梨黑斑病菌的PCR检测，M :2000bp marker ;泳道1 :以分离病菌提取 DNA为模板的PCR产物；泳道2-3 :以发病植株粗提取DNA为模板的PCR扩增产物；泳道4 : 健康植株对照；泳道5 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0013] 下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 制，仅作示例说明。
[0014] 实施例1 :设计、合成引物并建立梨黑斑病菌的PCR反应体系 一、引物设计与合成 特异性引物的设计：对GeneBank中梨黑斑病菌和其他属的rDNA-ITS序列进行分析，设 计了一对特异性引物，序列如下： HB1 ：TCACCCTTGTCTTTTGCGTA HB2 :ACCTTTGCTGATAGAGAGTG。
[0015] 设计的引物重新在GeneBank中BLAST分析验证其特异性。
[0016] 同时还使用了一对植物病原真菌ITS通用引物ITS1和ITS4作为套式PCR的外引 物，序列如下： ITS1 ：TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4 ：TCCTCCGCTTATTGATATGC 所有引物都委托上海生工合成部合成。
[0017] 二、建立常规PCR反应体系 常规 PCR 扩增体系为：10XTaq buffer 2. 5ML、25mmol/L MgCl22.〇ML、2.5mmol/L dNTP 2.0ML、10Mmol/L正反向引物各 1.0ML、5U/L Tagase 0.2ML、20 ng/MLDNA模板2ML,补 水至总体积25PL，在PCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序为：94°C预变性4min ;94°C变性 30s，55. 8°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 35 个循环；72°C延伸 10min，4°C保存。
[0018] 三、建立套式PCR反应体系 为提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系