一种基于cox-2基因检测胃癌易感性的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医疗研究领域，涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，具体涉及 一种基于C0X-2基因检测胃癌易感性的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 胃癌的发生与多种因素有关，其中饮食习惯，生活环境以及幽门螺杆菌的感染等 均是导致胃癌发生的高危因素。遗传因素也是一项重要的方面。基因的多态性是导致疾病 发生遗传以及疾病发生遗传易感性的重要方面。其中以单核苷酸多态性最为常见。
[0003] 单核苷酸多态性由于是人类基因组中最为常见的多态形式，因此其可以作为人类 疾病的一种特有基因。某一个或者几个的单核苷酸多态性可以代表某个单体区域的单核苷 酸多态性称之为标签单核苷酸多态性。
[0004] 环氧化酶（C0X)是花生四烯酸向前列腺素转化的关键酶，又被称为前列腺素过氧 化物合酶，是一种膜结合蛋白，其有两种同工酶。其中cox-1为结构性酶广泛分布于多种组 织之中，可自行表达，其催化作用所产生的物质对于稳定细胞结构有着重要的意义；C0X-2 为诱导型酶，在正常情况下仅在肾脏和脑组织中存在少量表达，而在其他细胞中则缺失，当 受到诱导刺激时表达可以发生改变。
[0005]本发明人研究发现，C0X-2-1195G/A(rs689466)及 C0X-2-8473T/C(rs5275)基因 型单核苷酸多态性与胃癌的发生有着相关性。但在临床检测中，样品有限，采用有限的样品 量，同时检测更多C0X的SNP位点对基于C0X-2基因检测胃癌易感性来说非常重要。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种基于C0X-2基因检测胃癌易感性的试剂盒及 其用途。
[0007] 第一方面，本发明提供了一种基于C0X-2基因检测胃癌易感性的试剂盒，包括： SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9 及 SEQ ID N0:10 所示核苷酸序列组成的多重 PCR 引物组。
[0008] 本发明提供的基于C0X-2基因检测胃癌易感性的试剂盒利用多重PCR引物对待测 样品进行多重PCR反应，可同时检测出C0X-2基因上rs689466号SNP位点和rs5275号SNP 位点，节约了临床样品资源，提高了样品利用率。
[0009] 优选地，所述基于C0X-2基因检测胃癌易感性的试剂盒中的多重PCR引物组用于 多重PCR反应，以扩增待测样品；其中，每个多重PCR反应体系中采用的多重PCR引物组总 浓度为10uM。
[0010] 进一步优选地，所述多重PCR反应程序为：
[0011]
[0012] 优选地，所述胃癌易感性的检测为针对云南省（优选为文山州）地区人群进行的 胃癌易感性检测。
[0013] 第二方面，本发明提供了一种评估人群胃癌易感性的方法，包括如下步骤：
[0014] 1)提取待测样品的DNA，采用多重PCR反应扩增提取的DNA样品，其中，所述多 重 PCR 反应采用的多重 PCR 引物组为 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9 及 SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列组成的多重PCR引物组；
[0015] 2)凝胶电泳分离纯化PCR产物片段；单碱基延伸后质谱检测SNP位点；
[0016] 3)对检测结果进行统计，获得人群胃癌易感性的评估结果。
[0017] 优选地，每个多重PCR反应体系中采用的多重PCR引物组总浓度为10uM。
[0018] 优选地，所述多重PCR反应程序为：
[0019]
[0020] 优选地，所述胃癌易感性的检测为针对云南省（优选为文山州）地区人群进行的 胃癌易感性检测。
[0021] 第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的基于C0X-2基因检测胃癌易感性 的试剂盒在检测C0X-2基因上的rs689466号和rs5275号SNP位点的基因型中的应用。
[0022] 本发明发现：采用本发明提供的试剂盒，同时对C0X-2基因上的rs689466号和 rs5275号SNP位点进行PCR扩增，检测发现：C0X-2-1195G/A及C0X-2-8473T/C基因型单核 苷酸多态性与胃癌的发生有着相关性，含有突变基因A和C者更容易发生胃癌。
【附图说明】 图 1 是本发明实施例提供的 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10 的多重PCR结果； 图 2 是本发明实施例提供的 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10 的多重PCR结果。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方 法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 仪器与试剂。所有的DNA引物均哟上海的英骏生物公司提供，采用酚氯仿法抽提 基因组。DNA Marker:东胜生物，Low ladder/marker，M1031。具体步骤如下：
[0026] 实施例1 SNP筛选
[0027] 采用Haploview的软件进行C0X-2基因的tagSNP筛选。然后再采用FastSNP对 候选的tag SNPs进行功能和风险预测，从而能够挑选一种具有潜在功能效应的SNPs。其中 对tag SNPs的风险评估依据主要是采用遗传风险评估方案进行评分。通过筛选，本文捕获 两个潜在的 tag SNPs (rs689466 以及 rs5275)。
[0028] 实施例2 DNA样品提取
[0029] 将采集的凝血块500 y 1大小并且将其置于离心管中，加入800 y 1的TE，混匀后进 行DNA的提取。混匀后进行离心操作，10000rpm/min，离心5分钟。然后依次加入400 y 1 的LTE，25 y 1的10%的SDS和5 y 1浓度为20mg/ml的PK液，过夜消化。消化结束后将其 上清液吸取并且同时加入等体积的酚，涡旋15分钟后再次离心。吸取上清液后加入1 :1的 氯仿和酚，再次涡旋离心。再吸取上清液，加入2倍的无水乙醇和3M的乙酸钠，在-20°C的 条件下进行沉淀反应。沉淀接受后弃去上清液，然后加入75%的乙醇再次离心。取出上清 液后将离心后的沉淀物质干燥，待用。
[0030] 实施例3引物设计
[0031] 采用Mass Assay Design 3. 1(美国sequenom公司）进行引物设计，设计PCR扩 增引物及延伸引物。
[0032] PCR扩增引物：
[0033] 针对rs689466号SNP位点的特异性引物设计3对：
[0034]第1对：
[0035] (SEQID N0:1)
[0036] 正义引物：5' -TCCGTGTCTCATGAAGAATCA-3'（Tm 值为 59°C )，
[0037] (SEQ ID NO:2)
[0038] 反义引物：5' -CTCCCTGATGCGTGGATTAT-3'（Tm 值为 60°C );
[0039]第2对：
[0040] (SEQ ID NO:3)
[0041]正义引物：5' -ATGCTCCTCCCTGAGCACTA-3'（Tm 值为 60°C )，
[0042] (SEQ ID NO:4)
[0043]反义引物：5'-GITTCCTGCCTTCTGATGGA-3'（Tm 值为 60°C );
[0044]第 3 对：
[0045] (SEQID NO:5)
[0046] 正义引物：5' -ATCTCACCCTCACATGCTCCT-3'（Tm 值为 61°C )，
[0047] (SEQIDNO:6)
[0048]反义引物：5'-AITTGCAGGGACGCTAAATGT-3'（Tm值为 61°C );
[0049] 针对rs5275号SNP位点的特异性引物设计2对：
[0050]第1对：
[0051] (SEQID NO:7)
[0052]正义引物：5 '-CCAGAGAGAAATGAGITITGACG-3'（Tm值为 60 °C )，
[0053] (SEQ ID NO:8)
[0054]反义引物：5'-ITGGTGAAAAAGGAACATCACTT-3'（Tm值为 60°C );
[0055]第2对：
[0056] (SEQID NO:9)
[0057]正义引物：5'-TCGATGITTCCAATGCATCT-3'（Tm值为 59. 5°C )，
[0058] (SEQ ID NO: 10)
[0059]反义引物：5'-T