双巯基大环化系统的制作方法
【专利说明】双巯基大环化系统
[0001] 本申请是申请日为2007年12月14日和发明名称为"双巯基大环化系统"的 200780050407. 3号发明专利申请的分案申请。
[0002] 夺叉参考
[0003] 本申请要求2006年12月14日提交的美国临时申请第60/874, 819号的优先权， 本文引入该申请作为参考。
[0004] 发曰月背景
[0005] 肽在药物发现中变得日益重要。未修饰的肽由于构象的柔性，经常具有较差的代 谢稳定性、较差的细胞渗透性和混杂的结合。为了改善这些性质，研究人员已通过包括二 硫键形成、酰胺键形成和碳-碳键形成的多种方法产生了环肽和拟肽（peptidomimetic) (Jackson 等人（1991)，J. Am. Chem. Soc. 113 :9391-9392 ;Phelan 等人（1997)，J. Am. Chem. Soc. 119 :455-460 ;Taylor(2002)，Biopolymers 66 :49-75 ;Brunel 等人（2005)，Chem. Commun. (20) :2552-2554!Hiroshige 等人（1995)，J.Am. Chem. Soc. 117 :11590-11591 ; Blackwell 等人（1998)，Angew. Chem. Int. Ed. 37 :3281-3284 ;Schafmeister 等人（2000)， J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892)。这些方法的局限性包括较差的代谢稳定性（二硫键和酰 胺键）、较差的细胞渗透性（二硫键和酰胺键）和潜在毒性金属的使用（碳-碳键）。
[0006] 发明概沐
[0007] 本发明提供了新的拟肽大环化合物（macrocycle)及其制备方法和用途。一般地， 这些拟肽大环化合物的合成包括：（1)合成含有2个游离-SH部分的前体肽；和（2)将前体 肽与双烷基化试剂接触，以产生新的拟肽大环化合物。这种通用方法允许前体肽中的至少 2个游离的疏基（thiolate)部分共价连接，以产生显示改善的生物学性质（如结构稳定性、 对靶标的亲和力、对蛋白水解降解作用的耐受和细胞渗透性）的新化合物。另外，这种通用 方法允许多种多样的部分快速和选择性地并入拟肽大环化合物中，以允许产生相关大环化 合物的文库。这种通用方法也允许容易地并入标记（例如，放射性同位素、化学发光或荧光 标记）或治疗剂。
[0008] 因此，一方面，本发明提供了式（I)的拟肽大环化合物：
[0009]
[0010] 其中：
[0011] A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
[0012] B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
-[NH-L4-CO-]、
[-NH-L4-SO2-]或[-NH-L4-];
[0013] &和R 2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂 环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
[0014] R3是氣、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳 基或杂环芳基，它们是未取代的或被1? 5取代的；
[0015] Lp L2、1^3和 L 4独立地是亚烷基、亚烯基（alkenylene)、亚炔基（alkynylene)、 亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基（cycloarylene)、亚杂环芳基 (heterocycloarylene)或[_R 4-K-R4-]n，每个是未取代的或被馬取代的；
[0016] K 是 0、S、SO、S02、C0、(：02或 CONR3;
[0017] 每个&是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基 (Arylene)或亚杂芳基（heteroarylene)；
[0018] 每个 R5独立地是卤素、烷基、_0R6、_N(R6)2、-SR 6、-S0R6、-S02R6、-CO2R 6、荧光部分、 放射性同位素或治疗剂；
[0019] 每个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、9?光部 分、放射性同位素或治疗剂；
[0020] R/是_H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳 基或杂环芳基，它们是未取代的或被R 5取代的，或作为与D残基所形成环状结构的一部分；
[0021] 1?8是_H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳 基或杂环芳基，它们是未取代的或被R 5取代的，或作为与E残基所形成环状结构的一部分；
[0022] V 是 1-1000 的整数；
[0023] w 是 1-1000 的整数；
[0024] X是0-10的整数；
[0025] y是0-10的整数；
[0026] z是0-10的整数；
[0027] η是1-5的整数；且
[0028] x+y+z 至少是 3。
[0029] 在某些实施方式中，拟肽大环化合物包含α -螺旋，且馬是-H。在某些实施方式 中，RJPR2中的至少一个是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环 烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。或者,RJPR 2两个都独立地是烷基、烯基、炔基、芳 基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。在其它 实施方式中，RjPR 2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基；或者，RjP R2两个都 独立地是未取代或被卤素取代的烷基。在其它的实施方式中，&和1?2中的至少一个是甲基， 或RJPR 2两个都是甲基。
[0030] 在某些实施方式中，D和E中的至少一个是被高分子量的脂质或烃取代的 天然或非天然的氨基酸。在其它实施方式中，D和E中的至少一个连接于另外的式 [-L 1-S-L2-S-L3-]的大环构成性连接体（macrocycle-forming linker)上。
[0031] 在某些情况下，拟肽大环化合物的二级结构比相应的非大环多肽的相应的二级 结构更稳定。在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物也包含Ct-螺旋。例如，这样 的α-螺旋包含1-5个转角（turn)。例如，这样的α-螺旋比相应的非大环多肽的α-螺 旋更稳定。在某些实施方式中，[-L 1-S-L2-S-L3-]跨越α -螺旋的1-5个转角，例如α -螺 旋的大约1、2、3、4或5个转角。例如，[-L1-S-L2-S-L3-]跨越α -螺旋的大约1个转角。 [-L1-S-L2-S-L3-]的示例性的长度是α -螺旋的每个转角大约5 大约9 I在某些实施 方式中，[-L1-S-L2-S-L3-]的长度近似等于大约5个-大约13个碳-碳键的长度，或大约7 个-大约10个碳-碳键的长度。在其它实施方式中，本发明的大环化合物包含大约17-25 个原子的环。
[0032] 在其它的实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包括包含大约2个转角的α -螺 旋。例如，[-L1-S-L2-S-L3-]的长度近似等于大约8个-大约16个碳-碳键的长度，或大 约10个-大约13个碳-碳键的长度。在其它实施方式中，本发明的大环化合物包含大约 29-大约37个原子的环。
[0033] 本发明也提供了式IIa的化合物：
[0034]
[0035] 其中：
[0036] R1是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基；
[0037] L1独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、 亚杂环芳基或[_R 4-K-R4-]n，它们是未取代的或被1?5取代的；
[0038] K 是 0、S、SO、S02、C0、。02或 CONR 3;
[0039] &是亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳 基；
[0040] R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR 6、-S0R6、-S02R6、-CO2R 6、荧光部分、放射 性同位素或治疗剂；
[0041] R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烷基、 荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
[0042] R/是_H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基或杂环烷基；
[0043] 馬和R i。独立地是-H或适于肽合成的保护基；
[0044] η是1-5的整数；
[0045] Q 是 S ;且
[0046] P是-Η、-三苯甲基、对甲氧基三苯甲基、-S叔丁基或任何其它适于肽合成的保护 基；或者，Q和P -起形成能够经化学转化成为-SH基团的部分。
[0047] 在某些实施方式中，R1是未取代的或被卤素取代的烷基。在其它实施方式中，R 1是 未取代的烷基。在其它的实施方式中，R1是甲基。在其它的实施方式中，RjP R1。中的至少 一个是适于肽合成的保护基。
[0048] 本发明也提供了一种试剂盒，该试剂盒包含：
[0049] a)式IIa的化合物和式IIb的化合物：
[0050]
[0051] 其中：
[0052] R1是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或 被卤素取代的；
[0053] 私是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代 的或被卤素取代的；
[0054] 1^和L 3独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环 芳基或亚杂环芳基或[-R 4-K-R4-]n，每个是未取代的或被馬取代的；
[0055] K 是 0、S、SO、S02、C0、。02或 CONR 3;
[0056] &是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳 基；
[0057] 每个 R5独立地是卤素、烷基、-OR 6、-N(R6) 2、-SR6、-S0R6、-SO2R6、-CO 2R6、-R6、荧光部 分、放射性同位素或治疗剂；
[0058] 每个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烧 基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
[0059] 馬和R 8独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基或杂环 烷基；
[0060] 馬和R i。各自独立地是-H或任何适于液相或固相肽合成的保护基；
[0061] Q 是 S;
[0062] P是-H、-三苯甲基、对甲氧基三苯甲基、-S叔丁基或任何其它适于液相或固相肽 合成的保护基；或者，Q和P -起形成能够经化学转化成为-SH基团的部分；η是1-5的整 数；
[0063] 和b)下式结构的大环构成性连接体：
[0064] X-L2-Y
[0065] 其中，1^2是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、 亚杂环芳基或[-R n-K-Rn-]n，每个是未取代的或被R12取代的；
[0066] 每个R11是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚 杂芳基；
[0067] 每个 R12独立地是卤素、烷基、-OR 13、-N(R6) 13、-SR13、-SOR13、-SO2R 13、-CO2R13、-R13、 荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
[0068] 每个R13独立地是-Η、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环 烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；且
[0069] X和Y各自独立地是能够与疏基（thiol group)反应的反应基团。
[0070] 在某些实施方式中，R2是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基， 它们是未取代的或被卤素取代的。在具体的这样的实施方式中，RJPR 2是烷基。例如，R1 和R2是甲基或三氟甲基。
[0071] -种合成拟肽大环化合物的方法，该方法包括将式III的拟肽前体与式X-L2-Y的 化合物接触的步骤：
[0072]
[0073] 其中，v、w、X、y、z、A、B、C、D、E、R!、R2、R7、Rs、L!、LjP L 3如对于式 I 的化合物所 定义；且X和Y各自独立地是能够与巯基反应的反应基团；
[0074] x+y+z 至少是 3 ;
[0075] 而且，进一步，其中，所述接触步骤导致在式III中的两个巯基之间形成共价连 接。
[0076] 在某些实施方式中，进行本发明的方法导致如本文所述的式（I)的拟肽大环化合 物的形成。
[0077] 在某些实施方式中，RJPR2中的至少一个是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、 环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。或者，&和1? 2两个都独 立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代 的或被卤素取代的。在其它实施方式中，&和R 2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的 烷基；或者，RjPR2两个都独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在其它的实施方式中， 札和R 2中的至少一个是甲基，或R JP R 2两个都是甲基。
[0078] 在某些实施方式中，在细胞中表达拟肽前体。在某些实施方式中，在接触步骤之 前也纯化拟肽前体。在某些情况下，将获得的拟肽大环化合物在接触步骤之后纯化，和/或 在接触步骤之后再折叠。
[0079] 例如，所述方法在溶液中进行，或在固体载体上进行。在某些情况下，在结合拟肽 前体的目标大分子的存在下，在有利于所述结合的条件下进行接触步骤，或者，在优先结合 拟肽前体的目标大分子的存在下，有利于所述结合的条件下进行接触步骤。在某些实施方 式中，应用所述方法合成拟肽大环化合物的文库。
[0080] 在某些实施方式中，通过本发明的方法制备的拟肽大环化合物在水溶液中包含 α -螺旋。在其它实施方式中，拟肽大环化合物在水溶液中比相应的非大环多肽显示增加的 α -螺旋结构。在其它的实施方式中，相比相应的非大环多肽，拟肽大环化合物显示提高的 热稳定性、提高的生物学活性、增强的对蛋白水解降解作用的耐受或提高的渗透活细胞的 能力。在某些实施方式中，式III的化合物的2个巯基部分是选自L-半胱氨酸、D-半胱氨 酸、α-甲基-L-半胱氨酸和α-甲基-D-半胱氨酸的氨基酸的侧链。在本发明的方法的 某些实施方式中，x+y+z为3,且A、B和C独立地是天然或非天然的氨基酸。
[0081] 例如，在选自质子溶剂、水溶剂、有机溶剂及其混合物的溶剂中进行所述方法。在 某些实施方式中，溶剂是DMF、二氯乙烷、NH 3、NH3/MeOH、NH3/DMF或盐酸胍水溶液。在某些实 施方式中，溶剂也是有利于螺旋形成的溶剂，例如水。
[0082] 在本文所述的化合物和方法的某些实施方式中，L2是烷基。在其它实施方式中，X 和Y独立地选自如Cl-、Br-或I-的卤素基团。
[0083] 特别地，本发明涉及以下各项：
[0084] 1.式（I)的拟肽大环化合物：
[0086] 其中：[0087] A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
[0085]
[0088] B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
-[NH-L4-CO-]、
[-NH-L4-SO2-]或[-NH-L4-];
[0089] 1^和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂 环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
[0090] R3是氣、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳 基或杂环芳基，它们是未取代的或被1? 5取代的；
[0091] L1、L2、L 4独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、 亚环芳基、亚杂环芳基或[-R 4-K-R4-]n，每个是未取代的或被馬取代的；
[0092] K 是 0、S、SO、S02、C0、。02或 CONR 3;
[0093] 每个&是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚 杂芳基；
[0094] 每个 R5独立地是卤素、烷基、_0R6、_N(R6)2、_SR 6、-S0R6、-SO2R6、-CO2R 6、荧光部分、 放射性同位素或治疗剂；
[0095] 每个1?6独立地是_H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、9?光部 分、放射性同位素或治疗剂；
[0096] R/是_H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳 基或杂环芳基，它们是未取代的或被R 5取代的，或作为与D残基所形成环状结构的一部分；
[0097] 1?8是_H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳 基或杂环芳基，它们是未取代的或被R 5取代的，或作为与E残基所形成环状结构的一部分；
[0098] V 是 1-1000 的整数；
[0099] w 是 1-1000 的整数；
[0100] X是0-10的整数；
[0101] y是0-10的整数；
[0102] z是0-10的整数；
[0103] η是1-5的整数；且
[0104] x+y+z 至少是 3。
[0105] 2.如第1项所述的拟肽大环化合物，其中，所述札和R2中的至少一个是烷基、烯 基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取 代的。
[0106] 3.如第1项所述的拟肽大环化合物，其中，所述RJPR2独立地是烷基、烯基、炔基、 芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。
[0107] 4.如第1项所述的拟肽大环化合物，其中，所述&和R2中的至少一个是未取代的 或被卤素取代的烷基。
[0108] 5.如第1项所述的拟肽大环化合物，其中，所述RJPR2独立地是未取代的或被卤 素取代的烷基。
[0109] 6.如第1项所述的拟肽大环化合物，其中，所述&和1?2中的至少一个是甲基。
[0110] 7.如第1项所述的拟肽大环化合物，其中，所述札和1?2是甲基。
[0111] 8.如第1项所述的拟肽大环化合物，其中，所述D和E中的至少一个是被高分子量 的脂质或烃取代的天然或非天然的氨基酸。
[0112] 9.如第1项所述的拟肽大环化合物，其中，所述D和E中的至少一个连接于另外的 式[-L 1-S-L2-S-L3-]的大环构成性连接体上。
[0113] 10.如第1项所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物的二级结构比相 应的非大环多肽的相应的二级结构更稳定。
[0114] 11.如第1项所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环包含α -螺旋。
[0115] 12.如第11项所述的拟肽大环化合物，其中，所述α-螺旋包含1-5个转角。
[0116] 13.如第11项所述的拟肽大环化合物，其中，所述α -螺旋比相应的非大环多肽的 α -螺旋更稳定。
[0117] 14.如第11项所述的拟肽大环化合物，其中，所述[-L1-S-L2-S-L 3-]跨越α -螺 旋的1-5个转角。
[0118] 1