一种抗人Oct4单克隆抗体及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物工程技术领域，具体涉及一种抗人〇Ct4单克隆抗体、用于制 备该单克隆抗体的重组蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在用 于检测样本中0ct4的表达和在用于制备肝癌的预后评估制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 0ct4 (Octamer-Binding Protein 4,又称P0U5F1)是维持干细胞多能性与自我更 新的重要的转录因子，主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎源性肿瘤中， 通过与靶基因的调控区结合，选择性抑制分化基因或促进多能性基因的表达。Oct-4由 Pou5Fl基因 （Gene ID :5460)编码，由于差异剪切有多个不同的亚型，分别称为0ct4A(360 个氨基酸残基，分子量39kD)、0ct4B (190个氨基酸残基，分子量19kD)和0ct4Bl (265个氨 基酸残基，分子量30kD)。只有0ct4A可以入核与0ct4调控基因的启动子结合，调控一系列 维持干细胞多能性与自我更新的基因的表达。
[0003] 肿瘤起始细胞（肿瘤干细胞）具有自我更新的能力，对放疗或化疗有更强的耐 受能力，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。肝癌中也存在肿瘤起始细胞，并且肿瘤起 始细胞的数目与肝癌的化疗抵抗相关（参见文献：Yang W et al.0V6+tumor-initiating cells contribute to tumor progression and invasion in human hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2012(57) :613 - 620)。但调控肝癌起始细胞的信号通路还不明确。 0ct4表达于肝癌起始细胞内，对这些细胞的"干性"具有重要作用，并且癌基因 PSMD10可 通过 WWP2 抑制 0ct4 的降解（参见文献 Qian Y，et al.p28GANKPrevents Degradation of 0ct4 and Promotes Expansion of Tumor-Initiating Cells in Hepatocarcinogenesis. Gastroenterology 2012 ； 142:1547-1558)
[0004] 曾有报道影响肝癌预后的因素主要是肿瘤大小和血管侵犯，并通常伴随肿瘤多发 性。目前，越来越多的研究表明预判肝癌的复发尚需发掘其他更为有效的预后因素。以往 研究提示肝癌起始细胞在肝癌发生发展中可能发挥了重要作用，但是它如何调控肝癌进程 尚不明确，至今未见肝癌干细胞及0ct4的表达水平可直接作为肝癌复发转移的预后判断 因素，以及用于肝癌个性化治疗的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种抗人0ct4单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的重 组蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体的应用。
[0006] 本发明人根据肝癌起始细胞中0ct4高表达及肝癌中ρ28ωΝΚ高表达现象，研究了 肝癌起始细胞中ρ28 ωΝΚ对0ct4调控的机制，通过实验发现，蛋白ρ28 ωΝΚ能够通过调控0ct4 降解酶WWP2的降解促进0ct4在肝癌起始细胞中的积累，并且发现肝癌患者样本中p28 GANK 与0ct4的表达与肝癌患者的预后呈明显负相关（参见文献Qian Y，et al.p28GANKPrevents Degradation of 0ct4 and Promotes Expansion of Tumor-Initiating Cells in Hepatocarcinogenesis. Gastroenterology 2〇12 ; 142:1547_1558)。如果应用 0ct4 的单克 隆抗体检测肝癌患者组织样本中0ct4的表达水平，依据0ct4的表达水平就能对患者的预 后作出预判分析；本发明进一步设想，如果用相应单克隆抗体抑制0ct4功能，阻断0ct4的 促癌作用，就有可能对那些自身肝脏中0ct4本底表达水平较高的患者起到个性化的治疗 效果。进而0ct4的单克隆抗体可以用于肝癌的预后判别以及个性化治疗。
[0007] 本发明的第一方面，提供了一种用于制备抗人0ct4单克隆抗体的多肽（重组蛋 白），其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示的。
[0008] 本发明按照上述氨基酸序列构建了原核表达质粒，在BL21(DE3)中进行表达，纯 化后得到了重组蛋白，用于制备0ct4的单克隆抗体。
[0009] 本发明的第二方面，提供了一种抗人0ct4单克隆抗体，是由保藏编号为CCTCC No :C2014205的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0010] 本发明提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC No :C2014205。
[0011] 本发明的杂交瘤细胞株，命名为Hyb-h0ct4-138。
[0012] 本发明的第三方面，提供了一种如上所述的抗人0ct4单克隆抗体（鼠抗人0ct4 单克隆抗体）的制备方法，该方法的步骤如下：
[0013] a)重组表达如SEQ ID NO :1所示的蛋白；
[0014] b)将上述蛋白作为免疫原免疫小鼠；
[0015] c)取免疫鼠的脾细胞融合；
[0016] d)经多轮筛选出合成多肽反应阳性的细胞克隆，作为抗人0ct4单克隆抗体的杂 交瘤细胞株；
[0017] e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗人 0ct4的单克隆抗体。
[0018] 所述的步骤a)，针对0ct4A的编码框氨基酸全序列设计并合成引物进行PCR克隆， 获得0ct4A的全长序列，序列SEQ ID NO :2所示。
[0019] 将上述PCR得到的cDNA片段导入pET21a⑴重组载体中，将该载体转化 BL21 (DE3)经诱导、裂解、纯化后得到重组0ct4蛋白。
[0020] 所述的步骤b)，将上述重组蛋白与弗氏佐剂混合，作为免疫原免疫小鼠。
[0021] 所述的步骤c)，取免疫鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；与小鼠的骨髓瘤细 胞SP2/0细胞融合，经筛选后即可获得杂交瘤细胞。
[0022] 本发明的杂交瘤细胞株，也称杂交瘤细胞系Hyb-h0ct4_138(即保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏日期2015年1月24日，保藏编号CCTCC No :C2014205)，所制备的单 克隆抗体是一种免疫球蛋白，可特异性结合人0ct4蛋白。
[0023] 本发明的第四方面，提供了一种如上所述的用于制备抗人0ct4单克隆抗体的多 肽（重组蛋白）、抗人0ct4单克隆抗体、分泌抗人0ct4单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备 检测肝癌预后判别的试剂或试剂盒中的应用。
[0024] 所述的检测肝癌预后判别的试剂或试剂盒，优选Western Blot或免疫组化试剂或 试剂盒。
[0025] 所述的检测肝癌预后判别的试剂或试剂盒，优选本发明抗人0ct4单克隆抗体和 抗人p28 SANK的单克隆抗体联用。
[0026] 所述的肝癌患者的预后判别，是应用免疫组化的方法应用人0ct4单克隆抗体检 测肝癌患者样本中0ct4的表达情况，通过计算得出每位患者癌及癌旁组织中相应分子的 平均表达强度。利用统计软件分析0ct4的表达与肝癌患者各种临床特征及预后参数（总 生存率、无瘤生存率、总生存时间、无瘤生存时间等）的关系，制成曲线图。
[0027] 本发明为肝癌患者的预后判别提供了新的检测方法，也为0ct4的临床个性化治 疗应用提供了新的思路。
【附图说明】
[0028] 图1是单克隆抗体Western Blot检测人0ct4蛋白的扫描图；其中，泳道1为 蛋白Marker (对应分子量写在左侧），泳道2为293T细胞裂解液（30 μ g)，泳道3为转染 pcDNA3. 1之293T细胞裂解液（30 μ g)，泳道4为转染pcDNA3. lA-h0ct4之293T细胞裂解 液（30 μ g)，泳道5为空白泳道，泳道6, 7, 8上样顺序同泳道2, 3, 4,但上样量为15 μ g。
[0029] 图2是单克隆抗体0ct4免疫组化检测人0ct4蛋白的组织切片图；其中，A为单克 隆抗体免疫组化检测的人精原细胞瘤组织（200X) ;B为单克隆抗体免疫组化检测正常肝 组织（200 X)。
[0030] 图3是抗人0ct4单克隆抗体免疫组化检测人肝癌样本中0ct4表达水平
[0031] 本发明的杂交瘤细胞株，命名为Hyb-h0ct4-138,保藏于中国典型培养物保藏中心 (简称CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2015年1月24日，保藏编号CCTCC No : C2014205。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明 范围的限制。
[0033] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0034] 实施例1.抗人0ct4的单克隆抗体的重组蛋白的制备
[0035] 1.原核表达载体的构建
[0036] 0ct4A有360个氨基酸，根据其cDNA序列信息委托百奇生物科技（上海）有限公 司设计了 PCR引物SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示：
[0037] 上游引物：CCGGAATTCATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATT(SEQ ID NO :3 所示）
[0038] 下游引物：ATAAGAATGCGGCCGCGITTGAATGCATGGGAG(SEQ ID NO :4 所示）
[0039] PCR获得0ct4的cDNA如SEQ ID NO :2所示，通过分子克隆的方式克隆到表达载 体pET2Ia (+)，方法可参见J ·萨姆布鲁克等著，金冬雁等译《分子克隆实验指南（第二版）》 工具书。
[0040] 2.重组蛋白的表达与纯化
[0041] 将序列100%匹配的质粒转化BL21 (