抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术制药工程技术领域，尤其涉及一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白 的制备方法，以及该融合蛋白在提高仔猪成活率以及降低保育猪的腹泻率、呼吸道病发病 率中的应用。
【背景技术】
[0002] 自抗生素问世以来，其在人类与动物的疾病治疗方面发挥了至关重要的作用，不 仅如此，抗生素作为人类的食品添加剂和动物饲料添加剂的应用也越来越多。正是由于抗 生素被广泛的应用甚至滥用，细菌的耐药性越来越来强，由此带来的抗生素的杀菌效果越 来越差，甚至出现一些抗生素无法杀死的超级细菌。因此寻找新的抗菌物质的任务迫在眉 睫。
[0003] 近些年出现的抗菌肽和溶菌酶是一类具有杀菌活性的天然多肽和蛋白，其做为抗 生素替代品已广泛的应用于医药临床和食品工业。1981年，人们第一次真正意义上发现抗 菌肽Cecropin，迄今为止仅在昆虫中就发现了超过2000种抗菌肽类物质，这些抗菌肽不仅 对细菌、真菌有抗菌能力，对病毒、原虫及癌细胞也有一定作用。溶菌酶作为机体非特异免 疫因子之一，也具有多种药理功效，如抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力、止血、凝血等。抗菌肽 的抗菌机理为带正电荷的抗菌肽与带有负电荷的细菌细胞膜结合，通过造成膜穿孔的或抑 制细菌的生理代谢过程造成细菌死亡。溶菌酶又称为胞壁质酶，其通过分解细胞壁上肽聚 糖的β_(1，4)糖苷键发挥其杀菌作用。目前，抗菌肽和溶菌酶主要都是单独存在而发挥其 抗菌功能，但由于其杀菌机理的不同，对不同菌株的杀菌方面具有一定的局限性，导致其各 自有较窄的抗菌谱，不能达到很好的杀菌效果。
[0004] 公告为CN101649311B的中国发明专利公开了一种人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白的 制备方法，它采用基因工程的方法构建人溶菌酶-抗菌肽重组质粒，然后在真核表达人溶 菌酶-抗菌肽融合蛋白，该融合蛋白的表达体系构建成本高，蛋白表达量少，不利于工业化 生产。
[0005] 目前也有研究者试图在原核表达溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，但是进展不佳，要么 融合蛋白不能够成功表达，要么融合蛋白虽然能够表达，但是只能表达在包涵体，导致后期 纯化复性难度大，对蛋白活性影响大，从而影响其后期功能实现和进一步应用。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服以上现有技术问题的不足，提供一种抗菌 肽-溶菌酶融合蛋白以及该融合蛋白的制备方法，该融合蛋白的表达体系采用在原核表达 融合蛋白，体系构建成本低，蛋白表达量大，更利于工业化生产，且融合蛋白成功表达在上 清，有利于融合蛋白后期的纯化复性，有利于保持融合蛋白的活性。
[0007] 本发明所采用的技术方案为提供一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白，它从N端-C端依 次包含了抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、Τ4溶菌酶蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。该融合蛋白是通过基因工程把抗菌肽thanatin(死亡素）的密码子与T4溶菌酶的 密码子串联起来，中间插入3GSA作为一段柔性肽，避免蛋白表达后抗菌肽与溶菌酶的结构 相互影响从而影响其各自的活性，并通过其N端与sumo蛋白结合，成功构建能够在原核表 达、并表达在上清的重组蛋白，其中抗菌肽thanatin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 示，3GSA柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，T4溶菌酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0008] 上述抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)采用人工合成的方法获得依次包含抗菌肽thanatin基因序列、3GSA柔性肽 基因序列、T4溶菌酶基因序列的tha-3GSA-T4基因序列，如SEQIDN0.6所示，其中抗菌肽 thanatin基因序列如SEQ ID NO. 7所示，3GSA柔性肽基因序列如SEQ ID NO. 8所示，T4溶 菌酶基因序列如SEQ ID NO. 9所示；
[0010] (2)以pETDuet质粒为载体，构建pETDuet-Sum〇-tha-3GSA_T4重组质粒，并转化至 大肠杆菌ToplO中，通过PCR、双酶切及测序鉴定，筛选得到阳性克隆；
[0011] (3)将阳性克隆即测序准确的pETDuet-Sum〇-tha-3GSA-T4重组质粒转化至大肠 杆菌宿主菌BL21(DE3)中，通过氨苄青霉素抗生素的筛选获得表达菌株；
[0012] (4)挑取 pETDuet-sum〇-tha-3GSA-T4/BL21 单克隆至 LB 培养基，LB 培养基中含 50ug/ml氨苄青霉素，37°C培养至OD6。。为0. 75-0. 85,加入终浓度0.1 mM的IPTG进行蛋白 诱导，诱导条件为16°C培养16-20h，得到在上清表达的Sum〇-tha-3GSA-T4融合蛋白；
[0013] (5)对得到的Sum〇-tha-3GSA-T4融合蛋白进行纯化，然后切除Sumo标签，得到抗 菌肽-溶菌酶融合蛋白。
[0014] 本发明进一步提供上述抗菌肽-溶菌酶融合蛋白在作为提高仔猪成活率、降低保 育猪腹泻率、降低保育猪呼吸道病发病率药物中的应用。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
[0016] (1)通过对抗菌肽基因和溶菌酶基因的选择，以及柔性肽和标签蛋白的选择和合 适排布，通过在基因工程上把抗菌肽thanatin和T4溶菌酶基因密码子串联并在二者间插 入3GSA柔性肽的方法，以sumo为融合蛋白，pETDuet为载体，在工程菌E. coli BL21 (DE3) 内成功表达一种同时具备结合抗菌肽和溶菌酶的抗菌能力的抗菌蛋白，且融合蛋白表达在 上清，表达量大，有利于后期的纯化复性以及融合蛋白活性的保证；
[0017] (2)通过基因重组的方式表达了结合抗菌肽和溶菌酶两种杀菌机制、活性更高、抗 菌谱更广的融合蛋白，该重组蛋白被证明在提高仔猪成活率、降低保育猪的腹泻率、降低保 育猪的呼吸道病发病率方面具有显著效果，可用于制备相关药物制剂。
【附图说明】
[0018] 图1所示的是本发明His6-Sum〇-tha-3GSA-T4融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳检 测图，其中I. marker ;2.总蛋白；3.破碎后上清；4.破碎后沉淀；5.过镍柱流穿；6.镍柱洗 脱液；
[0019] 图2所示的是本发明tha-3GSA-T4融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳检测图，其中 I. marker ;2.纯化后的 His6-Sum〇-tha-3GSA-T4 融合蛋白；3. UIPlcut ;4. tha-3GSA-T4 融 合蛋白；
[0020] 图3所示的是本发明Tha_T4融合蛋白对革兰氏阳性菌的抑菌效果图，其中 I. thanatinO. ImM/L ;2· T4 0· ImM/L ;3· tha、T4 各 0· ImM/L 的混合液；4. tha-T4 0· ImM/L ;
[0021] 图4所示的是本发明Tha_T4融合蛋白对革兰氏阴性菌的抑菌效果图，其中 I. thanatinO. ImM/L ;2· T4 0· ImM/L ;3· tha、T4 各 0· ImM/L 的混合液；4. tha-T4 0· ImM/L ;
[0022] 图5所示的是本发明实施例4中不同处理组仔猪生长性能比较；
[0023] 图6所示的是本发明实施例4中不同处理组仔猪健康水平比较。
【具体实施方式】
[0024] 以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示 性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语 具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0025] 实施例1 :抗菌肽Thanatin和T4溶菌酶的串联表达与蛋白纯化
[0026] 1、融合基因的设计与合成
[0027] 人死亡素（thanatian)和T4溶菌酶蛋白是以thanatian-连接肽-T4溶菌酶的方 式连接，因此thanatin基因在前，T4溶菌酶基因在后。
[0028] 连接肽选用3GSA片段，插入在抗菌肽和溶菌酶的基因之间，作为一段柔性肽，减 少两部分蛋白在结构上的影响，并增加融合蛋白表达的可溶性。
[0029] 在融合蛋白的N端添加 sumo蛋白，不仅起到助融作用，还有助于减小抗菌蛋白对 宿主细菌的毒性的活性，使其在宿主菌内大量表达。
[0030] 抗菌肽thanatin基因序列如SEQ ID NO. 7所示，3GSA柔性肽基因序列如SEQ ID NO. 8所示，T4溶菌酶基因序列如SEQ ID NO. 9所示。采用人工合成（苏州金唯智生物科技 有限公司）的方法获得依次包含Sumo蛋白基因序列、抗菌肽thanatin基因序列、3GSA柔性 肽基因序列、T4溶菌酶基因序列的tha-3GSA-T4基因序列，具体如SEQ ID NO. 6所示。
[0031] 设计的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白从N端-C端依次包含了抗菌肽thanatin蛋白、 3GSA柔性肽、T4溶菌酶蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其抗菌肽thanatin蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，3GSA柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，T4溶菌 酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0032] 2、重组质粒 pETDuet-Sum〇-tha-3GSA-T4 的构建
[0033] 以pETDuet质粒为载体，先构建包含His6_sumo序列的pETDuet-His6_sumo重组 载体，然后tha_3GSA_T4基因序列与经过BamHI和NotI双酶切的pETDuet-His6_sumo载体 连接，并转化至大肠杆菌ToplO中，通过PCR和双酶切鉴定，筛选阳性克隆，并送至上海生物 工程测序鉴定。His6-sumo基因序列如SEQ ID NO. 10所示，其编码的氨基酸序列如