诱导液和诱导培养基及诱导培养间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及一种诱导间充质干细胞的诱导液和诱导 培养基以及诱导培养的方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体等缺陷引起的糖、脂肪和蛋白 质代谢紊乱性疾病。临床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射胰岛素来治疗。而细 胞治疗是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治疗策略，尤其对于已经丧失胰岛细胞功能的糖 尿病患者来说，植入能分泌胰岛素的胰岛细胞或其替代物是最理想的治疗方法。目前，胰岛 细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难 极大的限制了这种疗法的应用。
[0003] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC)是一种具有多向分化潜能的细胞， 它能够定向诱导为胰岛样细胞、软骨细胞等多种细胞。且间充质细胞存在于人体多种组织 中，尤其是脐带、胎盘、脂肪组织来源的间充质干细胞，具有来源广泛、易于采集、无伦理问 题等优势，可规模化诱导分化为胰岛样细胞，为临床治疗糖尿病提供新的技术方案。
[0004] 目前将间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞团多采用贴壁诱导的方式。因间充质 干细胞有较强的贴壁性，在诱导过程中阻碍了细胞聚集成团，因此诱导率普遍较低，且诱导 后获得的胰岛样细胞的细胞活性较低、活细胞比率低、胰岛细胞不够成熟等问题。二部法或 者三步法，诱导因子使用较多，诱导周期一般为14-21天，诱导周期长、残留因子种类繁多； 且诱导率低，获得的胰岛细胞数量较少且胰岛细胞不够成熟，增加了临床应用的风险。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中诱导间充质干细胞转化成胰岛细 胞存在诱导率低、胰岛细胞活性低，不成熟等缺陷，提供一种能够将间充质干细胞转化为胰 岛细胞，且胰岛细胞活性较高的诱导液。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种诱导液，所述诱导液包括 尼克酰胺和细胞调节素。
[0007] 在本发明提供的诱导液中，所述诱导液中尼克酰胺的浓度为5_20ng/mL。
[0008] 在本发明提供的诱导液中，所述诱导液中0-细胞调节素的浓度为5-40ng/mL。
[0009] 在本发明提供的诱导液中，所述诱导液还包括HGF，且HGF的浓度为5-20ng/mL。 [0010]本发明还提供一种诱导培养基，包括基础培养基和上述的胰岛细胞诱导液。
[0011] 在本发明提供的诱导培养基中，所述基础培养基为n?M培养基或DMEM培养基，且 所述基础培养基中含有EGF、bFGF、银杏提取液和FCS。
[0012] 在本发明提供的胰岛细胞诱导培养基中，所述基础培养基中，EGF的浓度为 5-20ng/ml、bFGF的浓度为5-20ng/ml、银杏提取液的浓度为5-20ng/ml和FCS的质量分数 为 2-10%〇
[0013] 本发明进一步保护诱导培养间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0014] 获取间充质干细胞，并用诱导培养基进行诱导培养至转化成胰岛细胞；
[0015] 所述诱导培养基为上述的胰岛细胞诱导培养基。
[0016] 实施本发明提供的诱导液和诱导培养基，可以达到以下有益效果：该诱导液能够 促进MSC增殖分化，促进MSC转化成胰岛细胞团以及增大胰岛细胞；由本发明提供的诱导液 在MSC转化为胰岛细胞过程中的应用可知，通过本发明提供的诱导液诱导MSC转化成的胰 岛细胞的数量较多，活性及成熟度较强，且胰岛细胞质量较好，能够分泌较多的胰岛素。
【附图说明】
[0017] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0018] 图1为本发明诱导液诱导得到的胰岛细胞用PCR进行mRNA检测的电泳条带示意 图。
【具体实施方式】
[0019] 为解决现有技术中诱导MSC获得的胰岛细胞存在诱导转化率低，胰岛细胞活性低 等缺陷，本发明的创新点在于提供一种促进MSC转化成胰岛细胞的诱导液，通过在基础培 养基中加入促进MSC转化成胰岛细胞，且促进胰岛细胞成熟的尼克酰胺和0 -细胞调节素， 从而实现了提高MSC转化率及胰岛细胞活性、促进胰岛细胞成熟、提高胰岛细胞质量的目 的。
[0020] 具体地，本发明提供的诱导液，用于将MSC诱导转化为胰岛细胞，包括：尼克酰胺 和细胞调节素。
[0021] 尼克酰胺的主要作用是参与呼吸链，参与细胞增殖转化的呼吸过程及电子传递过 程，促进细胞的增殖转化，尼克酰胺是组成NAD+和NADP+的一个部分，组成的NAD+和NADP+ 通过电子传递链，传递H+，合成ATP;同时尼克酰胺能够调节细胞内的ATP/ADP的比例，从而 引起细胞膜上ATP敏感性钾通道的关闭，膜发生去极化，继而导致电压依赖性钙通道开放， 钙离子内流，触发了胰岛0细胞分泌胰岛素，可以促进MSC向胰岛样细胞分化，同时，促进 胰岛细胞成熟；优选地，本发明尼克酰胺的浓度为5-20ng/mL。
[0022] 与尼克酰胺作用机理类似，0 -细胞调节素具有诱导nestin阳性细胞分化为胰岛 素分泌细胞的能力，促进MSC向胰岛样细胞分化，并且能够促进胰岛细胞成熟，优选地，本 发明细胞调节素的浓度为5-40ng/mL。
[0023] 由于尼克酰胺参与细胞增殖转化的呼吸过程及电子传递过程，并能够协助合成 ATP为细胞的增殖分化提供能量，提高细胞活性的同时，也进一步促进了MSC转化成胰岛细 胞，因此，本发明中优先选用尼克酰胺，当然也可根据不同诱导培养方法、诱导细胞等需求 任意选择尼克酰胺和/或0 _细胞调节素。
[0024] 进一步地，本发明提供的诱导液中还包括HGF(hepatocytegrowthfactor，肝细 胞生长因子），HGF的浓度为5-20ng/mL，在MSC细胞分化为胰岛样细胞的过程中，对于细胞 起到保护作用的同时对细胞的扩增有着重要作用，能够促进胰岛细胞的发育和分化，进一 步提高胰岛细胞的活性及成熟度。
[0025] 本发明还保护一种胰岛细胞诱导培养基，包括诱导液和基础培养基。
[0026] 其中，诱导液包括尼克酰胺和细胞调节素，尼克酰胺的浓度为5_20ng/mL、 0 -细胞调节素的浓度为5-40ng/mL;进一步地，诱导液还包括HGF，HGF的浓度为5-20ng/ mL〇
[0027] 基础培养基可以是頂DM培养基或DMEM培养基，并且基础培养基中含有EGF(表皮 细胞生长因子）、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子）、银杏提取液和FCS(fetalcalfserum， 胎小牛血清）；其中，EGF的浓度为5-20ng/ml、bFGF的浓度为为5-20ng/ml、银杏提取液的 浓度为为5-20ng/ml和FCS的质量分数为2-10%。EGF能够促进人脐带间充质干细胞的 增殖，以及胰岛细胞团的形成；bFGF不仅能促进MSC的增殖以及细胞体积的增大，还有助于 MSC转化成胰岛细胞。因此，本发明提供的诱导液不仅能够促进MSC转化成胰岛细胞，而且 可促进胰岛细胞的成熟，提高细胞活性，同时，促进MSC细胞和胰岛细胞的增殖及细胞体积 的增大；银杏提取液，是根据国际标准提取工艺提取的，也可购于德国舒培大药厂，商品名 金纳多；银杏提取液中含有黄酮类及银杏内酯等，能够中和掉细胞培养过程中积累的氧自 由基，这样可以使得细胞分裂到很高的密度而不死亡，从而有利于人脐带间充质干细胞的 增殖，降低细胞的氧化作用，提高细胞内谷胱甘肽的水平，清除氧自由基，有利于人脐带间 充质干细胞的转化；FCS含有丰富的细胞生长必须的营养成份，提供对维持细胞指数生长 的激素，是细胞贴壁、铺展在培养基质上所需因子来源，并提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传 代时剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害，同时，起酸碱度缓冲液作用。
[0028] 进一步地，本发明还保护一种诱导培养胰岛细胞的方法，包括如下步骤：
[0029] 获取间充质干细胞，并用诱导液或诱导培养基进行诱导培养至MSC转化为胰岛细 胞；其中，诱导液为上述本发明提供的诱导液；诱导培养基为上述本发明提供的诱导培养 基。
[0030] 具体地，取第三代MSC，置于培养箱中，并按以下步骤对第三代MSC进行诱导：
[0031] 1、获取人脐带间充质干细胞进行体外培养；
[0032] 2、再加入诱导液或诱导培养基对人脐带间充质干细胞进行诱导培养至转化成胰 岛细胞；
[0033] 步骤1中所采用的培养基可以是頂DM或DMEM培养基，并且培养基中还含有 EGF(表皮生长因子）、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子）、银杏提取液和FCS(胎牛血清）。 该步骤主要是为人脐带间充质干细胞转化作准备，包括人脐带间充质干细胞的增殖、细胞 体积增大，增强人脐带间充质干细胞活性等，因此，在该步骤中，基础培养基中添加的物质 也并不局限于上述本发明所提供的物质。
[0034] 步骤2中，诱导液包括尼克酰胺和/或细胞调节素，尼克酰胺的浓度为 5-20ng/mL、0 -细胞调节素的浓度为5-40ng/mL;进一步地，诱导液还包括HGF，且HGF的 浓度为5-20ng/mL。诱导培养基包括上述诱导液和基础培养基，基础培养基可以是頂DM培 养基或DMEM培养基，并且基础培养基中含有EGF、bFGF、银杏提取液和FCS;EGF的浓度为 5-20ng/ml、bFGF的浓度为5-20ng/ml、银杏提取液的浓度为5-20ng/ml和FCS的质量分数 为 2-10%〇
[0035] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合本发明提供的诱 导液在MSC转化为胰岛细胞过程中的应用的实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当 理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0036] 实施例1
[0037] 本发明提供的hUC-MSC转化为胰岛细胞的方法包括以下步骤：
[0038] 在本实施例中，人脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，包括以下步骤：
[0039] 1、获取人脐带间充质干细胞；<