一种干细胞生物制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种干细胞生物制剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面起着去氧化，储存肝糖， 分泌性蛋白质的合成等等的作用。肝脏也制造消化系统中之胆汁。在医学用字上，常以拉 丁语字首H印ato-或H印atic来描述肝脏。肝脏是人体内脏里最大的器官，位于人体中的 腹部位置，在右侧横隔膜之下，位于胆囊之前端且于右边肾脏的前方，胃的上方。由于肝脏 体积大，质地脆，因此极易受到损伤。
[0003] 肝损伤是全世界内的常见病，严重的肝损伤会发展成为肝硬化及肝癌，严重威胁 到人类健康。肝损伤分为急性和慢性肝损伤，一般情况下，急性肝损伤会发生黄疸，肝功能 下降、胆红素升高、转氨酶升高；慢性肝损伤会有体乏无力，食欲不振。肝损伤一般包括有脂 肪肝、药物性肝病、自身免疫性肝病、肝炎。肝损伤发病原因很多，主要有化学性肝损伤、药 物性肝损伤、情志性肝损伤，病毒性肝损伤等。
[0004] 目前，主要多采用化学合成类药物对肝损伤进行治疗，如a- (2, 4-二氯苯基）-咪 唑-1-乙醇、氯醛、氨基三唑、2, 3-脱氢水飞蓟宾等。这些化学合成类药物可以减少肝脏损 伤部位的变性坏死细胞，缩小肝脏坏死区域，从而对肝损伤起到一定的治疗作用，但其治疗 效果并不理想。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种干细胞生物制剂及其制备方法和应用，本 发明提供的干细胞生物制剂对肝损伤具有较好的治疗效果。
[0006] 本发明提供了 一种干细胞生物制剂，包括肝干细胞、外周血干细胞、白蛋白和溶 剂。
[0007] 优选的，所述肝干细胞在所述生物制剂中的含量为5X106~2X10 7个/mL。
[0008] 优选的，所述外周血干细胞在所述生物制剂中的含量为5X105~2X10 6个/mL。
[0009] 优选的，所述白蛋白在所述生物制剂中的含量为1~20wt%。
[0010] 优选的，所述肝干细胞为肝源性肝干细胞。
[0011] 优选的，所述溶剂为生理盐水。
[0012] 本发明提供了一种干细胞生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0013]a)、肝干细胞、外周血干细胞、白蛋白和溶剂混合，得到干细胞生物制剂。
[0014] 优选的，所述步骤a)具体为：
[0015]al)、将白蛋白和溶剂混合，得到白蛋白溶液；
[0016]a2)、肝干细胞、外周血干细胞和所述白蛋白溶液混合，得到干细胞生物制剂。
[0017] 优选的，所述外周血干细胞按照以下步骤获得：
[0018]bl)、外周血进行离心分离，得到外周血单个核细胞；
[0019]b2)、培养所述外周血单个核细胞，得到外周血干细胞。
[0020]优选的，所述步骤b2)具体为：
[0021] 传代培养所述单个核细胞至P2~P3代，得到外周血干细胞。
[0022] 本发明提供了一种上述技术方案所述生物制剂或上述技术方案所述制备方法制 得生物制剂在制备治疗肝损伤药物的应用。
[0023] 与现有技术相比，本发明提供了一种干细胞生物制剂及其制备方法和应用。本发 明提供的干细胞生物制剂包括肝干细胞、外周血干细胞、白蛋白和溶剂。本发明提供的干细 胞生物制剂含有肝干细胞、外周血干细胞和白蛋白，通过三者的协同作用，能够有效促进肝 脏损伤部位的组织再生，从而实现较好的肝损伤治疗效果。实验结果表明，采用本发明提供 的生物制剂治疗急性肝损伤的大鼠时，大鼠血液中的ALT、AST和TBIL指标均有明显降低， 其中，ALT指标由治疗前的约95± 10下降至75. 33± 10. 03以下，AST指标由治疗前的约 77±5下降至61. 32±4. 96以下，TBIL指标由治疗前的约20±5下降至9. 01±5. 66以下， 说明本发明提供的生物制剂能明显的改善大鼠的肝损伤。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 提供的附图获得其他的附图。
[0025] 图1是本发明实施例7提供的肝干细胞在显微镜下观察到的细胞形态；
[0026] 图2是本发明实施例7提供的肝干细胞活力检测图；
[0027] 图3是本发明实施例7提供的肝干细胞的FSC-A(forwardscatter-area)图；
[0028] 图4是本发明实施例7提供的肝干细胞的⑶44-A(CD44单克隆抗体-area)图；
[0029] 图5是本发明实施例7提供的肝干细胞的⑶105_A(CD105单克隆抗体-area)图；
[0030] 图6是本发明实施例7提供的肝干细胞的HLA-DR-A(HLA-DR单克隆抗体-area) 图；
[0031] 图7是本发明实施例7提供的肝干细胞的⑶45-A(⑶45单克隆抗体-area)图；
[0032] 图8是本发明实施例7提供的肝干细胞的FSC-A(forwardscatter-area)图；
[0033] 图9是本发明实施例7提供的同型对照的⑶44_A(CD44单克隆抗体-area)图；
[0034] 图10是本发明实施例7提供的同型对照的CD105_A(CD105单克隆抗体-area) 图；
[0035] 图11是本发明实施例7提供的同型对照的HLA-DR-A(HLA-DR单克隆抗体-area) 图；
[0036] 图12是本发明实施例7提供的同型对照的CD45_A(CD45单克隆抗体-area)图；
[0037] 图13是本发明实施例9提供的血清总蛋白量柱状图。
【具体实施方式】
[0038] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例 仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0039] 本发明提供了 一种干细胞生物制剂，包括肝干细胞、外周血干细胞、白蛋白和溶 剂。
[0040] 本发明提供的干细胞生物制剂包括肝干细胞、外周血干细胞、白蛋白和溶剂。其 中，所述肝干细胞是本发明提供的生物制剂的主要活性组分。在本发明中，肝干细胞的主 要作用是通过与制剂中的其他组分协同作用实现肝脏损伤部位的组织再生，从而达到治疗 肝损伤的目的。在本发明提供的一个实施例中，所述肝干细胞在所述生物制剂中的含量为 10 6~10s个/mL;在本发明提供的另一个实施例中，所述肝干细胞在所述生物制剂中的含量 为5X106~2X10 7个/mL;在本发明提供的其他实施例中，所述肝干细胞在所述生物制剂 中的含量为5X106~1X10 7个/mL。本发明对所述肝干细胞的来源没有特别限定，采用本 领域技术人员熟知的肝干细胞的获取方式获得肝干细胞即可。在本发明提供的一个实施例 中，所述肝干细胞为肝源性肝干细胞。在本发明提供的一个实施例中，可以按照以步骤获得 肝干细胞：
[0041] 肝脏组织依次进行消化处理和离心分离，得到细胞沉淀；所述细胞沉淀进行传代 培养，得到肝干细胞。
[0042] 在本发明提供的上述脂肪干细胞的获得方式中，首先对脂肪组织进行消化处理。 所述消化处理使用的消化液优选为胰酶消化液和II型胶原酶溶液。所述胰酶消化液中胰 酶含量优选为〇. 1~〇. 5g/100mL，更优选为0. 25g/100mL;所述II型胶原酶溶液中II型胶 原酶的含量优选为〇. 1~〇. 5g/100mL，更优选为0. 25g/100mL。所述消化处理的具体过程 为：先使用胰酶消化液进行消化，再使用II型胶原酶溶液进行消化。其中，胰酶消化液消化 过程中，优选现在3~6°C下消化8~16h，之后再在30~40°C下消化5~lOmin。II型胶 原酶溶液化过程中，所述消化的的温度优选为30~40°C，更优选为37°C;所述消化的时间 优选为5~lOmin。消化处理结束后，对消化处理后的肝脏组织进行过滤。所述过滤采用的 筛网优选为200~300目。过滤得到的肝脏组织悬液进行离心分离。所述离心分离的离心 力优选为100~400g，更优选为250~300g。所述离心分离的时间优选为3~lOmin，更优 选为5~6min。离心分离结束后，弃上层液体，收集下层细胞沉淀。
[0043] 在本发明中，为了提高获得的脂肪干细胞的纯净度，优选对所述细胞沉淀进行洗 涤。所述洗涤采用的试剂优选为磷酸盐缓冲液（简称PBS)。
[0044] 得到细胞沉淀后，对细胞沉淀进行传代培养，得到肝干细胞，该过程具体为：
[0045] 首先，将所述细胞沉淀与培养液混合，得到细胞悬液。所述培养液优选为含胎牛血 清（FetalBo