一种用于提取植物有效成分的复合酶制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶制剂制备技术领域，具体是一种用于提取人参皂甙、银杏皂甙及萌 芦科植物类原料中的多糖、皂甙等有效功能性成分的复合酶制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 植物中含有丰富的活性成分，被广泛用于药品、保健品和化妆品中。我国的植物资 源十分丰富，是我国具有独特开发利用优势和发展战略产业的物资基础。大力发展农产品 深加工，提高我国农产品加工业的技术创新能力和产品竞争力，是促进农业结构调整，增加 农村第二、三产业的就业岗位和提升食品加工工业的整体水平的重要途径。人参皂甙、银杏 皂甙及萌芦科植物(苦瓜、南瓜、黄瓜等）中有效成分(多糖、皂甙等）在我国已成为支撑中药 产业及健康产业发展的台柱。
[0003] 植物的有效成分如多糖、皂甙等大多包裹在细胞壁中，对这些有效成分的提取，传 统的提取方法如煎煮、有机溶剂浸出、醇处理方法等，提取时温度高、提取率低、浪费提取 剂、成本高、不安全；而采用酶法提取选用适当的酶，可以通过酶反应温和地将植物组织结 构分解，加速有效成分的释放提取。选用相应的酶可将影响液体制剂澄清度的杂质如淀粉、 蛋白质、果胶等分解祛除，也可能使一些较低或无生理活性的成分结构发生转变，成为高活 性分子，如可以使某些极性低的脂溶成分转化成糖苷类易溶于水的成分而有利于提取。酶 法在植物有效成分的提取中有较大的应用潜力，但该技术也存在一定的局限性。目前常用 的均为单一的液体剂型酶品种，加酶时要分部加入，因而生产工艺复杂，不便掌握及规模化 生产。酶提取法对实验条件要求比较高，为使酶发挥最大作用，需先通过实验确定，掌握最 适合的pH值、温度及作用时间等。还需综合考虑酶及底物浓度、抑制剂和激动剂等对提取 得率的影响。
[0004] 苦瓜为萌芦科苦瓜属植物，原产于印度东部，广泛分布于热带、亚热带和温带 地区，我国各地均有栽培。苦瓜味苦性寒，无毒，其根、茎、叶、花、果实和种子在世界各地 均有药用记载，有明显的清火明目、解毒、降血糖、滋养、益气之功效，是民间常用中药，同 时也是一种常见的蔬菜。国内外对苦瓜药用价值的研究已经取得了重要进展，已证实苦瓜 原汁、苦瓜的水提取物等具有抗菌、调节和提高机体免疫力、抗肿瘤、抑制爱滋病HIV的表 面活性等功效。国内外不少学者从不同地区、不同品种苦瓜及其种子中分离出了多种生理 活性物质，其中苦瓜多糖和苦瓜皂甙是苦瓜的两个主要有效成分。
[0005] 皂甙是存在于植物界的一类比较复杂的甙类化合物，如人参、柴胡、三七、苦瓜、 麦门冬、木通、茶叶等均含有皂甙。它是由甙元和糖两部分组成，由于分子量大、极性较 高，难以分离提纯。苦瓜皂甙是苦瓜中有效成分之一，为四环三萜类化合物。
[0006] 多糖是植物细胞的组成成分。近年来，多糖及其复合物在生物体功能方面的研究 成为热点问题之一。在研究过程中，人们发现多糖作为一种几乎无毒副作用的天然提取 物，在治疗肿瘤、免疫力低下、高血糖、衰老、病毒性疾病等方面疗效独特。苦瓜多糖是一 种由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的杂多糖，含0 -D-吡喃糖苷 键，具有提高免疫力、降血糖、抑菌、抗氧化等作用，是苦瓜中主要生物活性成分之一。
【发明内容】
[0007]本发明采用的提取植物有效成分的复合酶制剂由木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、 0 _葡聚糖酶、a-淀粉酶组成，是一种多菌种酶体系、固体剂型的新型食品级酶制剂。
[0008]植物细胞壁是由果胶质、纤维素和半纤维素等组成的网状结构，可阻止细胞内有 效成分的渗出，要提取多糖、皂甙等植物有效成分，破除包围在这些有效成分外的屏障 是要解决的首要问题。
[0009]本发明采用的植物提取复合酶的制备方法是由地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、黑 曲霉、绿色木霉按照一定比例经过共生培养，浸提、浓缩后加膨化植物蛋白载体，经低温喷 雾制成。创新点在于将目前分步、添加单一酶种对人参皂甙、银杏皂甙及萌芦科植物类原料 的酶解过程，提升为多酶种的复合型酶制剂一步完成酶解过程，简化生产过程及周期，提高 人参皂甙、银杏皂甙及萌芦科植物类原料中的多糖、皂甙等有效功能性成分的提取效率。
[0010] 为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容： 一种用于提取植物有效成分的复合酶制剂，其特征在于它是由木聚糖酶、纤维素酶、果 胶酶、葡聚糖酶、a-淀粉酶成分组成，其各酶种的活力如下： 木聚糖酶3000IU/g;纤维素酶2000IU/g; 果胶酶20000IU/g; 0 -葡聚糖酶5000IU/g;a_ 淀粉酶 3000IU/g。
[0011] 本发明所述用于提取植物有效成分的复合酶制剂的生产方法，其特征在于它是 由地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、绿色木霉经过共生培养，浸提、浓缩后加膨化植物 蛋白载体，经低温喷雾制成，其各菌粉的重量份数如下： 地衣芽孢杆菌3-4份；枯草芽孢杆菌1-2份； 黑曲霉2-3份； 绿色木霉2-3份； 其中各组分的活菌含量分别为： 复合发酵剂活力总数彡l〇scfu/g。
[0012] 具体包括：斜面菌种一液体种子培养一种子罐发酵一发酵罐发酵一离心分离菌体 细胞一陶瓷膜超滤浓缩酶液一添加膨化植物蛋白载体一低温喷雾干燥一过筛一固体复合 酶产品。
[0013] 更加详细的描述如下： (1)各菌株来源： 地衣芽抱杆菌 编号CGMCC1970 ; 枯草芽抱杆菌 编号ASL1229 ; 黑曲霉 供'，编号IFFI. 02439 ; 绿色木霉rricAot/eiwaKirit/e，编号CCTCCAF. 93252。
[0014](2)斜面菌种培养： 地衣芽孢杆菌使用斜面培养基（g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,酵母膏5,NaCl5,琼脂30， 自来水配制，pH7. 5,在28~30°C条件下静止培养20~24小时； 枯草芽孢杆菌使用斜面培养基（g/L):蛋白胨10,牛肉膏5,氯化钠5,琼脂20,pH值为 7. 2,在28~30°C条件下静止培养20~24小时； 黑曲霉菌种使用斜面培养基（g/L): 土豆200,葡萄糖20,磷酸氢二钾3,七水硫酸镁 1. 5,pH自然，在28~30°C条件下静止培养20~48小时； 绿色木霉使用斜面培养基（g/L):羧甲基纤维素钠（CMC-Na)7. 5，蛋白胨5.0，吐 温-80 2. 0mL，MgS04 ? 7H20 0? 3,CaCl2 0? 3,FeS04 ? 7H20 5. 0mg，MnS04 ?H20 1. 6mg， ZnS04 ? 7H20 1. 4mg，CoCl2 ? 6H20 2. 0mg，自然pH，在 28 ~30°C条件下静止培养 48 ~72 小时； (3) 液体种子培养： 地衣芽孢杆菌摇瓶放大培养基（g/L):魔芋粉30,骨胨30,玉米浆5,（NH4)2S04 5，Na2HP04 4,KH2P04 0 . 3,MgCl20.6,CaCl2 3,FeS04 0 . 01，Na2C03 3,pH7.0,温度 30°C，转速 250 ~360r/min，培养 48 ~72h。
[0015] 枯草芽孢杆菌摇瓶放大培养基（g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,氯化钠5,pH值为 7. 2,温度 30°C，转速 140r/min，培养 24h; 黑曲霉摇瓶放大培养基（g/L):半纤维素15~20,NH4N032~4,酵母粉2~4,KCL0. 4~ 0? 6,K2HP040 . 5 ~1. 5,FeS040 . 01 ~0? 03,MgS04 ? 7H200. 3 ~0? 6,C〇CL20. 01 ~0? 03,吐温 0? 5~1. 5,pH5. 5。温度28~30°C，转速180~250转/分钟，培养48~60h; 绿色木霉摇瓶放大培养基（g/L):蛋白胨11. 0,硫酸铵13,葡萄糖6,KH2P04 10. 5,稻草粉13.4，。&(：120.8，]\%504.711 20 0.6，卩6504.71120 5,211504.71120 1.4 11^，(：〇(：12.611203.7 mg，MnS04.H20 1.6mg，吐温-80 0. 3mL，接种斜面培养的孢子，28°C，150r/min，振荡培 养72h左右； (4) 种子罐发酵： 种子罐发酵培养基（g/L):黄豆饼粉10. 1、玉米淀粉16. 9、蛋白胨1. 1、葡萄糖2. 4、硫酸 铵8. 0、硫酸镁0? 45、磷酸氢二钾0? 45、氯化钠4. 50，自然pH。
[0016] 发酵罐内温度28~30°C，通风量9~13m3/h，发酵罐压0? 02~0? 09Mpa，地衣 芽孢杆菌接种量10 %、枯草芽孢杆菌接种量3 %、黑曲霉接种量6 %、绿色木霉接种量6 %， 发酵48h。
[0017] (4)发酵罐发酵： 种子罐发酵培养基（g/L):骨胨30,玉米浆5,（NH4) 2S04 5,g，稻草粉13. 4g，Na2HP04 4,H2P04 0? 3,MgCl2 0? 6,CaCl23,FeS04 0? 01，Na2C03 3,吐温-80 0? 3mL，pH7. 0,消泡油 4， 自来水配制； 发酵罐内温度28~30 °C，通风量8~10m3/h，发酵罐压0.02~0.09Mpa搅拌速率 270r/min，接种量 10%，发酵 68 ~72h; (5) 离心分离菌体细胞：发酵液经管式离心机分离，收集滤液于储罐。
[0018] (6)陶瓷膜超滤浓缩酶液：将储罐中滤液进行超滤膜浓缩，超滤压力小于0.IMpa， 浓缩时间3小时/6吨滤液； (7)添加载体：向浓缩酶液中加入膨化大豆颗粒作为载体，使其在浓缩酶液中的终浓度 达到10%，并于匀浆中充分搅拌混匀； (8)低温喷雾干燥：将已加入载体的浓缩酶液经过高速气流浓缩低温喷雾干燥机进行 喷雾干燥制成固体复合酶产品。复合酶的有效成分收率90%以上。
[0019] 本发明更进一步公开公开了用于提取植物有效成分的复合酶制剂在制备提高人 参皂甙、银杏皂甙及萌芦科植物类原料中的多糖、皂甙有效功能性成分提取率方面的应用。 本发明将目前分步、添加单一酶种对人参皂甙、银杏皂甙及萌芦科植物类原料的酶解过程， 提升为多酶种的复合型酶制剂一步完成酶解过程，简化生产过程及周期，提高人参皂甙、银 杏皂甙及萌芦科植物类原料中的多糖、皂甙等有效功能性成分的提取效率。实验结果显示： 采用本发明的复合酶制剂对人参皂甙、银杏皂甙及萌芦科植物类原料中的多糖、皂甙等有 效功能性成分的提取效率可提高近10%。
[0020] 本发明制备的固体复合酶制剂产品的测定指标如下： (1)产品酶活力木聚糖酶3000IU/g ;纤维素酶2000IU/g ;果胶酶20000I